| 研究課題/領域番号 |
15K19629
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
川原 勇太 自治医科大学, 医学部, 助教 (10570385)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | T-ALL / 新規ABL1融合遺伝子 / ABL1 / UBAP2L / RT-PCR / EcoR1 / BamH1 |
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| 研究実績の概要 |
1.ウイルスベクターの増幅
まず、PCR産物を増幅するために使用するウイルスベクター（pGEM-3zf(+)）を、コンピテントセルの形質転換によって、増幅した。
2.RT-PCRによるライゲーション可能なUBAP2L-ABL1キメラ遺伝子の産生およびUBAP2L-ABL1キメラ遺伝子のウイルスベクターへのライゲーション
UBAP2L-ABL1融合遺伝子をクローニングするために、EcoR1-Not1-BamH1アダプターを使用してUBAP2L-ABL1の融合部前後の1000bpのPCR産物のウイルスベクターへのライゲーションを試みたが、上手くいかず、想定以上に時間を要した。PCR産物のリン酸化やベクターの脱リン酸化、digestする制限酵素の組み合わせの変更、PCR産物の濃度の変更などを行ったが、最終的には、プライマーにEcoR1およびBamH1切断部位をつけて、患者cDNAをPCRして得られたPCR産物を使用することによって、ウイルスベクターにライゲーションすることができた。
今後は融合遺伝子の全長のクローニングおよびマウス血球系細胞株への導入を行う。また、本白血病細胞およびT細胞性急性リンパ性白血病細胞株のUBAP2Lの遺伝子発現量を、リアルタイムPCRによって解析する予定である。UBAP2L遺伝子の白血病発症への関与の報告はこれまでになく、今後この融合遺伝子の機能解析を行うことは、白血病全体の治療戦略を立てる上で非常に意義がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
当初の計画では、平成27年度に新規ABL1融合遺伝子の全長クローニングと発現ベクターへの導入までを行う予定であったが、新規ABL1融合遺伝子の全長クローニングと発現ベクターへの導入はまだ行うことができていない。遅れている理由としては、白血病細胞株が
樹立できず、RNAシークエンスを行ったため、それに時間を費やしたためである。また、現在は全長クローニングを遂行中だが、新規ABL1融合遺伝子として同定されたUBAP2L-ABL1融合遺伝子の全長がとても長く、全長クローニングの困難さとなっている。そのため、制限酵素地図の作成に長期間を要した。また、制限酵素地図作成後に、最初にRT-PCRで得られたUBAP2L-ABL1融合遺伝子のPCR産物が短すぎてライゲーションができないことが判明し、プライマーを再設計しRT-PCRをやり直さなければならなかったことも、遅れている理由である。さらに、UBAP2L-ABL1融合遺伝子をクローニングするために、EcoR1-Not1-BamH1アダプターを使用したが上手くいかず、想定以上に時間を要したことも、遅れている理由の1つである。診療業務が多忙であったことも、遅延した理由の1つである。
一方、当初AF1q遺伝子を新規ABL1パートナー遺伝子として想定していたが、実際はUBAP2L遺伝子が同定されており、これは当初予定していたRT-PCRによる新規ABL1パートナー遺伝子の同定方法では、困難であったと思われる。この過程に関しては、RNAシークエンスを用いることによって短縮できたと考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
1．新規ABL1融合遺伝子の全長クローニングと発現ベクターへの導入：RT-PCRと制限酵素切断、ライゲーションによって、UBAP2L-ABL1融合遺伝子の全長のcDNAをクローニングし、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む発現ベクターに挿入する。このプラスミドを大腸菌に導入して増やし、十分な量の全長cDNAを含むプラスミドを得る。
2．マウス血球系細胞株にABL1融合遺伝子を導入する：作成したABL1融合遺伝子の全長cDNAを含む発現ベクターを、マウスIL-2依存性細胞株CTLL-2に導入し、ネオマイシンで全長cDNAを発現する細胞株をセレクションする。
3．新規ABL1融合遺伝子を導入したCTLL-2細胞株の機能解析
①増殖能の解析：CTLL-2は増殖にIL-2を必要としIL-2非存在下ではアポトーシスに至る。新規ABL1融合遺伝子を導入したCTLL-2の細胞増殖を解析するために、トリパンブルー色素排除法を用いて、IL-2非存在下での生細胞数をカウントし、増殖曲線を作成する。②抗ア
ポトーシス効果の解析：IL-2非依存性増殖能が抗アポトーシス効果によるものかどうかを調べるために、フローサイトメトリーを用い、アネキシンⅤの発現を解析する。③細胞周期の解析：IL-2非依存性増殖能が増殖シグナル亢進によるものかどうかを調べるために、フローサイトメトリーを用いDNA量を調べ、細胞周期の解析を行う。
4．新規ABL1融合遺伝子を導入したCTLL-2細胞株に対するTKIの増殖抑制効果の検証：新規ABL1融合遺伝子を導入したCTLL-2細胞株に対するTKIの有効性を調べるために、培養液にTKIを添加し、TKIによってCTLL-2細胞株の増殖が、どれくらいの濃度で抑制されるかどうかを解析する。なお、診療業務は半年程度軽減できる予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）
平成29年度は、ウイルスベクターの増幅や制限酵素切断部位をつけたプライマーを使用したRT-PCRによって制限酵素切断部位のついたUBAP2L-ABL1融合遺伝子産物を得ることができたが、全長クローニング、発現ベクターへの導入及び細胞株への遺伝子導入は施行できなかった。また、本白血病細胞やT-ALL細胞株のUBAP2Lの遺伝子発現量をリアルタイムPCRで解析する予定である。細胞培養関連費（培養液、フラスコ、ピペット、サイトカインなど）やリアルタイムPCR関連費として、次年度使用額が生じた。
（使用計画）
平成30年度は、全長クローニングの継続、発現ベクターへの導入及び細胞株への遺伝子導入、本白血病細胞やT-ALL細胞株のUBAP2Lの遺伝子発現量の解析を行う予定であり、細胞培養関連費（培養液、フラスコ、ピペット、サイトカインなど）やリアルタイムPCR関連費として使用する予定である。
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