2016 年度実施状況報告書

皮膚老化ホルモンの研究

研究課題

研究課題/領域番号	15K19698
研究機関	札幌医科大学
研究代表者	國本梨沙札幌医科大学, 医学部, 助教 (20468094)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2019-03-31
キーワード	Prl2c3 / 皮膚老化 / SIRT1
研究実績の概要	Prl2c3は皮膚基底細胞や毛包に発現する。そこで、皮膚基底細胞や毛包でPrl2c3を過剰に発現するマウスを作成した。ケラチン5は皮膚基底細胞や毛包に限局して発現することが報告されているため（Diamond I et al. J Invest. Dermatol. 115, 778, 2000) 、ケラチン5のプロモータ領域をPCRでクローン化して、Prl2c3遺伝子の上流に結合させたコンストラクトを作成し、トランスジェニックマウス（Prl-TGマウス)を作成した。Prl-TGマウスについてそのdevelopment、皮膚、毛について正常マウスと比較検討した。加齢による皮膚老化現象の指標として真皮層の菲薄化があるが、Prl-TGマウスでは同年齢のコントロールマウスに比べて真皮層が菲薄化する傾向を認めた。老化細胞の数や分布を組織学的に検討して、Prl-TGマウスで細胞老化が進んでいるかSPiDER-bGal染色をして検討中である。細胞老化で発現が高まるp16, p21, p27やPAI-1、さらにIL-6, IL-8などのsenescence associated secretary pathway (SASP)の発現亢進が見られるか、抗体を用いた免疫組織及びWestern blotやRT-PCR法で調べた。また、agingとの関連を調べるためにいろいろな年齢のPrl-TGマウスと同年齢のコントロールマウスの組織を比較した。その結果について検討中である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由計画通り、Prl2c3トランスジェニックマウス(Prl-TGマウス)を作成した。採取した皮膚について組織学的に老化関連抗体を使用し、蛍光顕微鏡での観察、PCR、Western blotでWild typeのマウスと比較検討しているが今年度中に結果を出したかった。また、Prl-TGマウスのメラノサイトの数や分布についても、メラノサイトマーカーのチロシナーゼの発現で検討し、コントロールマウスと比較検討したい。
今後の研究の推進方策	今後は、計画の通りに、C2C12筋芽細胞ではSIRT1のノックダウンによりPrl2c3 mRNAの発現が増加し、SIRT1活性化剤であるレスベラトロール処理によりPrl2c3 mRNA発現は減少した。このメカニズムについて検討する。SIRT1の過剰発現によりPrl2c3の発現が抑制されるかを調べる。さらに、SIRT1の転写制御機能を調べるため、Prl2c3遺伝子プロモータ部分をマウスゲノムよりPCRにより単離して、pGL3ベクターluciferase遺伝子上流にクローニングしluciferase assayを行う。SIRT1の過剰発現やノックダウン、SIRT1活性化薬や阻害薬の作用を調べ、SIRT1がPrl2c3の転写に作用するか検討する。作用が見られる場合はPrl2c3 プロモータ領域のdeletion mutantsを作成し、SIRT1の作用部位がプロモータ領域のどの部分であるか検討する。別の検討方法としてSIRT1抗体によるChIP assayをおこない、SIRT1がPrl2c3遺伝子のどの領域に結合するかを調べたい。また、Prl2c3の作用を調べるため、マウスに精製したPrl2c3を局所投与してその作用を調べる。皮膚の脱色や脱毛作用、体毛の白化作用や表皮の菲薄化について調べる。Prl2c3の長期投与作用を調べるために浸透圧ポンプ(Alzet)を用いて長期的な作用について検討する。Prl2c3の作用を市販の培養皮膚細胞（クラボウ）を用いてさらに検討する。特にメラノサイトの減少作用のメカニズムを明らかとする。メラノサイトが特にPrl2c3によって細胞老化を起こしやすいかどうかを他の細胞への作用と比較検討する。美白効果や毛髪の色への作用を十分に検討する他、メラノーマの治療に応用できる可能性を考えB16F1細胞等のメラノーマ細胞へのPrl2c3の作用を詳細に検討する。
次年度使用額が生じた理由	実験のための物品費は使用したが、謝金を使用しなかったため。学会への参加はできた。
次年度使用額の使用計画	次年度は論文作成・投稿のための経費として使用したい。