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膵胆道癌患者からの腫瘍促進マクロファージ単離ができず、実験計画の再検討を余儀なくされた。当初検討していたCpG-siRNAの治療応用を鑑みたとき、腫瘍細胞および腫瘍微小環境間質細胞のTLR9発現とその相互作用が重要である観点から、研究計画を再度検討し、実行可能および意義のある実験系として、CpG刺激下大腸癌細胞での遺伝子発現変化および周囲微小環境との相互作用を観察する予定とし、研究をすすめた。SW480細胞を用いて、CpG-ODN刺激下での腫瘍微小環境調節因子の遺伝子発現を調べたが意義深い結果はみられず、TLR9の周囲微小環境への影響はin vitroでは見出すことが困難と判断した。そこで細胞内に存在する他のToll様受容体と学内協力体制から実現可能な研究を考慮し、TLR3に着目した。
TLR3は化学療法や放射線療法などの外的ストレスにより腫瘍細胞がnecrosisを起こし、それから放出されるDAMPsと呼ばれる内在性因子が腫瘍微小環境において腫瘍促進にも抑制にも働くとされている。ヒト外科切除標本を用い免疫染色を行うとTLR3陽性群においてリンパ節転移陰性例が有意に多く見られた。再発率はTLR3陰性群において高い傾向にあった。 SW480にTLR3アゴニストであるpoly I:Cをtreatmentした際に誘導されるchemokineをPCR及びELISAで確認すると、CCL2、CCL5、IL-8の遺伝子発現亢進とタンパクの発現が認められた。siRNAでTLR3ノックダウンを行うと、上記ケモカインの発現が有意に抑制された。以上から、腫瘍細胞におけるTLR3はCCL2、CCL5、IL-8の発現により周囲微小環境に影響を与え、転移抑制に関連することが示唆された。
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