| 研究課題/領域番号 |
15K19941
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
橋本 崇史 大分大学, 医学部, 特任助教 (40738126)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 非小細胞肺癌 / 上皮成長因子受容体 / tumor evolution / 腫瘍内不均一性 / APOBEC / 免疫染色 / RT-PCR / 次世代シーケンス |
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| 研究実績の概要 |
EGFR陽性肺癌のうち、Common mutationによる変異蛋白を標的とした抗体を用いて免疫染色を開始するにあたり、L858R特異的抗体を用いた免疫染色を先行することとした。2004年-2014年に当科で外科切除されたEGFR陽性肺癌 (L858R陽性)を対象とし、FFPEスライドより脱パラフィン化し、賦活化ののちに一次抗体EGF Receptor (L858R Mutant Specific) (43B2) Rabbit mAb (Cell signaling社)を用いて反応させた。2013年より以前の症例では染色性が安定しなかったため、比較的新しい2014年-2015年のEGFR陽性肺癌を対象と再設定した。評価は染色強度(score 0-3)と、それぞれの陽性細胞割合(0-100%)で行った。陽性細胞割合に関しては×200倍視野で、腫瘍細胞ごとに評価を行い、その割合を調査した。対象は24例(2014年 12例/2015年 12例)であり、このうち3例 (12.5%)が、腫瘍内に不染帯を含む、不均一な染色を認めた。また、腫瘍全体が染色されるものの、部位ごとに染色強度に差異を認めるものは15例 (62.5%)であった。
腫瘍内不均一性を認めた症例において、染色性の異なる箇所からそれぞれマイクロダイセクションを行い、ゲノム抽出を進行中で、今後q-PCRや次世代シーケンスにより遺伝子発現量や変異の差異の有無を調査する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１）L858R免疫組織化学における染色安定性をえるのに時間を要していること。
２）マイクロダイセクションの手技確立に時間を要していること。
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| 今後の研究の推進方策 |
2016年以降の症例に関しても、免疫染色による不均一性の評価を進めていくと同時に、マイクロダイセクションによるゲノム抽出を進め、同一腫瘍内におけるEGFRコピー数の差異を、スマートサイクラー(Takara社)を用いた半定量的q-PCRにより評価を計画している。また、Miseq (イルミナ社)による次世代シーケンスを自施設で導入予定であり、遺伝子変異、増幅の網羅的解析によって腫瘍内不均一性を証明していく。
また、腫瘍内不均一性の原因として、APOBEC3Bの関与を有力視しており、凍結標本からRNA抽出を行い、APOBEC3Bの発現割合を調査していく。前実験として、一次抗体としてAnti-APOBEC3B antibody - N-terminal (ab191695) (アブカム社)を用いた免疫染色での発現を評価し、L858R特異的蛋白の腫瘍内不均一発現との関連を調査していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
計画の遅延により、試薬や抗体購入が少なかったことや、当初予定していた学会報告も行わなかったため、予算を余すこととなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度は次世代シーケンスの導入と学会発表により、今年度に繰り越し金を使用予定である。
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