| 研究課題/領域番号 |
15K20049
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
久保田 陽秋 琉球大学, 医学部附属病院, 助教 (10600421)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 脳虚血 / 再灌流 / 一酸化窒素合成酵素 / テストステロン / 酸化ストレス / ミトコンドリア機能不全 / 性差 / マウス |
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| 研究実績の概要 |
平成27年度までに得た結果から、NOSs系完全欠損下でのテストステロン（男性ホルモン）の有無が脳梗塞病態に影響している可能性を考えた。NOSs系完全欠損マウスにおいてMCA閉塞によって誘導した脳梗塞の大きさはオス＜メスであったので、平成28年度はMCA閉塞に先立って精巣を除去した場合にNOSs系完全欠損オスマウスにおいて脳梗塞が大きくなる、という仮説のもとに実験を行った。偽手術群に比して精巣摘除群で脳梗塞巣サイズが大きくなる結果が得られた。次に、この精巣除去効果がテストステロンの補充によって打ち消されるか確認実験を行った。すなわち精巣摘除後のマウスにテストステロンまたは溶媒が緩徐に浸み出すようなチューブの埋め込みを行ったのちにMCA閉塞を行ったところ、テストステロン補充群で溶媒群に比して脳梗塞が小さくなる結果が得られた。これにより、NOSs完全欠損下では、テストステロンの保護効果があることが示唆された。
オスにおいて、野生型マウスとNOSs系完全欠損マウス間で、MCA閉塞処置後にどのような遺伝子発現の違いがあるのかを網羅的かつ定量的に調べる目的で、MCA閉塞から２時間後の脳検体を用いてRNA次世代シーケンサー解析を行った。ミトコンドリア機能不全および酸化ストレスのシグナルに２種間で差があり、NOSs系完全欠損マウスでは野生型マウスと比較し、これらのシグナルを抑制する遺伝子の動きを認めた。
テストステロンの細胞修復と生存への作用は細胞傷害が軽度な場合は問題なく有益に機能するが、傷害が高度な場合は、細胞修復に大量のエネルギーを消費し、それが原因となる細胞死を誘導する。NOSs系完全欠損マウスのMCA閉塞処置後は、活性窒素種peroxynitriteの産生が有意に少なくなることがわかっていて、細胞傷害が軽度であるためテストステロンによるエネルギー枯渇が生じにくい可能性を考える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度末に計画を修正し、次世代シーケンシング解析を計画した。平成28年度は次世代シーケンシング解析により、ミトコンドリア機能不全と酸化ストレスに関わるシグナルの抑制がNOSs完全欠損マウスの脳虚血再灌流後の脳内で認められ、病態機序の解明に向けて前進することができた。この得られた結果を基に、今後さらに周辺分子機序の確認を行っていく。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）次世代シーケンシング解析が高額であるために、今回は脳梗塞誘導半球でのRNA解析のみに留めた。反対側半球でのRNA解析も追加し、NOSs系完全欠損マウスと野生型マウスの通常脳組織での遺伝子発現の違いを解析する必要があるので、研究費が確保でき次第追加する予定である。
（２）周辺分子機序の確認をウエスタンブロットで行っていく。
（３）病理学的解析として、MCA閉塞処置後に発生するフリーラジカルによるDNA傷害の程度を抗8-OHdG抗体を用いて定量する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度末までに購入予定であった、統計解析ソフトGraphPad Prism7の納入時期の関係で、次年度に持ち越しし、使用することとなったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記の通り、統計解析ソフトを購入し、今後の研究結果解析と学術公開に使用する予定である。
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