| 研究課題/領域番号 |
15K20064
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
大下 健輔 久留米大学, 医学部, 助教 (70529510)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | HCN / 後根神経節 / 脊髄後角 / 遺伝子治療 / 炎症性疼痛 |
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| 研究実績の概要 |
過分極誘発陽イオンチャネルはHCN1～4のサブタイプがあり、そのうちHCN2は疼痛治療のターゲットとして注目されつつある。そこでHCN2の優性抑制変異体を作成し、アデノ随伴ウイルスベクターを使って脊髄後根神経節細胞に発現させ、局所的かつ選択的にHCN2の機能を抑制する。これによって炎症性疼痛を軽減することができるか検討し、疼痛治療の新たな戦略を開発することを目的とした。現在HCN2-AAAのcDNAをレンチウイルスベクターにサブクローニングし、実際のウイルス粒子の作成ステップまできている。また、マウスの後根神経節の摘出、酵素処理後の初代培養に成功した。ホールセルパッチクランプ法を用いて、初代培養後3日目の単離後根神経節細胞から、自発活動電位の記録に成功した。さらに、同一細胞において過分極で時間依存性に増大し、caesium sensitiveであるHCN電流の記録に成功した。次にウイルス粒子の作動確認を行う予定である。一方でHCN2と同様に細胞内cAMP感受性を持つHCN4の痛覚伝導路に対する関与を調べた。マウス生体内におけるHCN4の分布を調べるため、HCN4の翻訳開始点にルシフェラーゼ遺伝子をノックインしたマウス (HCN4 +/Lcu)を作製した。中枢神経系におけるHCN4由来の化学発光を検索したところ、脊髄後角に一致したシグナルを認めることができた。さらに免疫組織染色を用いてHCN4発現部位を詳細に検討したところ、脊髄後角第Ⅱ層のニューロンに選択的にHCN4が発現していることが判明した。このHCN4 +/Lcuマウスを用いて、炎症性疼痛モデルを作成した。ホルマリン注入側の脊髄後角における化学発光が24時間、48時間後に低下していることが明らかとなった。HCN4は脊髄において後角第2層に特異的に発現しており、炎症性疼痛によりHCN4発現が変化することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ウイルス粒子作成段階まで研究は進行中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、培養後根神経節細胞を用いてウイルスベクターを投与し、パッチクランプ法も用いて、作動確認を行う。加えて、HCN4の脊髄後角における生理的機能も電気生理学的に解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
27年度に後根神経節の単離培養を行う予定であったが、脊髄後角を用いた実験解析を多く行ったため、培地等の消耗品の使用が少なく、未使用額が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
28年度に実際に培養後根神経節を用いた実験系を行うこととし、未使用額はその経費に充てることとした。
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