| 研究課題/領域番号 |
15K20145
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
竹谷 俊明 山口大学, 医学部附属病院, 講師 (70464328)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 子宮内膜 / 脱落膜化 / インスリンシグナル / グルコース |
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| 研究実績の概要 |
脱落膜化過程で起こる多くの遺伝子の発現変化は、ヒストン修飾というエピジェネティックな側面からも制御を受けている。次世代シークエンサーを用いたゲノムワイド解析により、脱落膜化でヒストン修飾の変化を伴い発現が上昇する遺伝子群の中にインスリンシグナル関連遺伝子群が存在している。本研究では、インスリンシグナル遺伝子群の活性化が脱落膜化にどのように関与しているのかを解明する。
RNA-sequence の結果より、ヒストン修飾の増加を伴い発現が上昇したインスリンシグナル関連遺伝子群 (INSR, IRS, MAPK10, AKT3）は、バリデーションのためにH3K27ac 抗体によるChIP-qPCR とrealtime RT-PCR を行った。その結果、これらの遺伝子は、脱落膜化によりヒストン修飾が増加し、発現が上昇していることを確認した。また、グルコースの取り込み能が上昇していた。
インスリンシグナルの機能のひとつであるグルコースの取り込みに注目し、脱落膜化でのグルコースの役割について検討した。ESC を通常培養よりも低濃度のグルコース含有の培養液下で脱落膜化を誘導すると、脱落膜化マーカーであるIGFBP-1、PRL 遺伝子発現の上昇が抑制された。また、IGFBP-1とPRL 発現に関与する転写因子FOXO1の発現の上昇も抑制された。
FOXO1 の脱落膜化マーカー発現への関与を確認するためにFOXO1 をノックダウンしたESC について、脱落膜化を誘導したところ、IGFBP-1とPRL の発現の上昇が抑制された。
以上より、脱落膜化で上昇するESC グルコースの取り込みは、IGFBP-1とPRL の転写因子であるFOXO1の発現上昇に寄与していることが明らかとなっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
脱落膜化における子宮内膜間質細胞のインスリンシグナル活性化とインスリンシグナルにより取り込まれたグルコースの役割を明らかにするために① ChIP-sequenceとRNA-sequence の結果のバリデーションをとる。② 脱落膜化にはグルコースが不可欠であることを明らかにする。③グルコースによる脱落膜化の分子メカニズムを明らかにする。以上の計画を立てた。現在、①、②まで進んでおり、① ChIP-sequenceとRNA-sequence の結果を受けて、脱落膜化でインスリンシグナル遺伝子群がヒストン修飾の増加を伴い発現が上昇しているのかバリデーションをとった。また、② 低グルコース培養下での脱落膜化誘導実験により、脱落膜化にはグルコースが必要であることを調べた。以上より、研究はおおむね順調に進展しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、研究計画③のインスリンシグナルの活性化により取り込まれたグルコースが脱落膜化にどのように貢献しているのか分子メカニズムを明らかにしていく。そのために、低グルコース培養下で培養したESC についてH3K27ac によるChIPを行い、低グルコース培養下で発現の上昇が抑制されたFOXO1のChIP-qPCR を行う。この実験により、脱落膜化におけるグルコースとFOXO1の発現上昇との関連性を調べ、グルコースが担う脱落膜化の分子メカニズムを明らかにしていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予備実験が完了していたので、グルコースの取り込み実験に使用する高価なキットを節約することができた。PCR やウェスタンブロットの試薬を節約することができたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
グルコースのFOXO1発現への分子メカニズムを調べるために、FOXO1のChIP実験を行う予定である。平成28年度には、FOXO1抗体が必要となってくる。FOXO1のChIP実験の条件検討はこれからである。この実験の最適化を行うために十分な抗体量を確保したい。これらの実験を行う購入費に充当する。
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