卵巣黄体機能低下とCalpastatinの関係

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K20167
• 研究機関: 聖マリアンナ医科大学
• 研究代表者: 川島 一公 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 研究員 (40633946)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 黄体 / 更年期障害 / 排卵 / 閉経

研究実績の概要

細胞内にある酵素カルパインは、マウス卵巣の卵胞内にある顆粒膜細胞の黄体化に関与しており、排卵ホルモンによる刺激を引き金として、その酵素活性によってエストロジェン合成からプロジェステロン合成細胞へと分化することを見出している。しかし、女性の更年期障害の前期にみられる黄体機能不全はエストロジェンが高値となることから、カルパインの酵素活性が損なわれているために引き起こされているのではないかと考えた。そこで、本研究では、カルパインの内因性の抑制因子であるカルパスタチンに着目し、その発現を調べ、卵巣の顆粒膜細胞特異的な過剰発現マウスの作出を目指している。これまでに、生後３週齢、30週齢、60週齢のマウス卵巣の顆粒膜細胞における遺伝子発現を調べ、加齢が進行するにつれカルパスタチンの遺伝子発現が３週齢と比較して両者の遺伝子発現が有意に増加していることを見出した。この結果は加齢によってカルパインの活性が損なわれているという仮説を裏付ける結果である。次に、カルパスタチン過剰発現系を立ち上げるために、カルパスタチン遺伝子とプロモーターにCyp19a1のプロモーターを接続したプラスミドを複数作出している。さらに、Cyp19a1は複数の転写開始点を持つことから作成したプラスミドが機能するかを検証する必要がある。そこで検討するための顆粒膜細胞の不死化細胞を現在作出している。顆粒膜細胞の不死化を達成したのちには直ちに最適な配列の選定を行い遺伝子組み換えマウスを作出し、加齢モデルマウスの検証を行う。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

複数の転写開始点を持つCyp19a1を用いたプロモーターを使用するため、転写効率を最大にした配列であることを確認した後に遺伝子導入を行いたいと考えている。従ってそれらを確認するアッセイを行うための細胞種の樹立を行っていることから研究が遅延した

今後の研究の推進方策

作成している複数のCyp19a1遺伝子のプロモーターにカルパスタチン遺伝子を含むプラスミドの中から最も発現効率の高いプラスミドを選択する。従って、それらを選択するために、不死化したマウス由来の顆粒膜細胞を作出する。作出後はそれぞれのベクターを挿入し、卵胞発育ホルモンの添加によってカルパスタチンの遺伝子発現が最大となる配列を選択する。その後、crispr cas9システムを用いて受精卵に挿入し、卵巣特異的にカルパスタチンを過剰に発現する遺伝子組み換えマウスを作出し、若齢時から更年期障害を呈するかを検証する。