ホールマウント標本による末梢神経再生の観察

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K20308
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 親松 宏 新潟大学, 医歯学総合病院, 特任助教 (70748607)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 末梢神経再生

研究実績の概要

末梢神経損傷が起こったときに起こる神経再生の際に軸索がどのように伸長するか、また、どのようなカタチで剪定、整理されていくかという経時的な形態学的変化を末梢神経のホールマウント標本を用いて、より三次元的に様々な角度から観察することを目標に実験開始した。
平成27年度は神経未損傷モデルを用いて抗ニューロフィラメント抗体で免疫染色しバックグラウンドを極力排除したホールマウント標本を作成することを目標とした。そののち、抗リン酸化GAP-43抗体でも同時に免疫染色を行い、ホールマウント標本を作成することを目指した。
ラットを灌流固定した後に前肢の神経を採取し、さらに後固定を行い、抗ニューロフィラメント抗体で免疫染色を行い、DAB発色させた。軸索を抗体で検出することは十分可能であったが、同時にバックグラウンドが非常に強く出てしまい、標本全体がDABに染まり十分な観察ができない状況であった。抗体との反応時間、発色剤の反応時間、洗浄方法、など各工程を再確認しながら試行錯誤を重ねたがやはりバックグラウンドの問題が克服できない状態であった。そのため、27年度は標本を透徹する段階まで計画していたが達成できなかった。
28年度は各条件の再検討を行ったが、やはりバックグラウンドの問題は一向に克服できなかった。透徹方法に関しては、これまでグリセリンによる末梢神経の透徹法を当研究室では行ってきたが、新たにキットとして市販されているものが有るため、そちらでの方法を試みる予定である。バックグラウンド問題以外はホールマウント標本の内部までを免疫染色する固定方法や処理方法を確立することができた。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

神経ホールマウントモデルの免疫染色を行ったが、バックグラウンドが非常に強く出てしまい、検出したい部分の染色との判別が困難な状態となった。染色時間、洗浄方法などを試行錯誤したがやはり克服できなかった。

今後の研究の推進方策

今後も試行錯誤を重ね、ホールマウント標本での免疫染色結果を安定させる。
その後新たなキットを用いて透徹標本を作成する。

次年度使用額が生じた理由

実験が当初の計画通り進行しなかったために必要な効き、消耗品を必要としなかったため

次年度使用額の使用計画

実験を進め、必要な機器、消耗品の購入に充当する。