| 研究課題/領域番号 |
15K20369
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
福島 美和子 昭和大学, 歯学部, 助教 (90548273)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 亜鉛 / 唾液腺 / 加齢 / 発生 / ZnT4 |
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| 研究実績の概要 |
１．昨年度に水分泌能を測定した亜鉛トランスポーターZnT4の自然発症型ミュータントマウスC57BL/6J-Slc30a4lm/J(lmマウス)のヘテロマウスを70週まで維持し、顎下腺を摘出して加齢による形態変化を検討した。マクロ所見及びHE染色による観察の結果では、野生型マウスとlmヘテロマウスの顎下腺にはサイズ、形態に変化はみられなかった。ヘテロマウスにおいては加齢時の唾液腺におけるZnT4の機能に差がみられないことが示唆された。
２．ヒト正常顎下腺腺房細胞のNS-SV-AC細胞(AC細胞)におけるZnT4の分泌における機能と役割を解明するため、準備段階としてAC細胞のタンパク質分泌機能を検討した。無血清培地でβ受容体刺激薬およびcAMP活性化剤を用いて細胞を刺激し、培地を回収して濃縮後、分泌タンパク質に対するWestern blottingを行った。結果、イソプロテレノールおよびジブチリルcAMPを用いても、濃度依存性、時間依存性のどちらも細胞外へのアミラーゼ、ムチン分泌を誘導しなかった。本細胞にはアミラーゼ分泌顆粒が存在することが報告されていたが、開口放出性の細胞外への分泌を誘導することは困難であることが示唆された。
３．顎下腺の発生過程におけるマウスZnT4遺伝子(mZnT4)の発現量を検討したところ、胎生期では発現量が低く、成獣で最も高いことが示された。このことは、ZnT4が高分化細胞で主に機能することを示唆している。
以上の結果から、新年度では１．ホモlmマウスと野生型マウスの顎下腺における形態変化の検討を行う。２．AC細胞に代わりマウス顎下腺初代培養細胞を行い、RNAiによる形態変化の検討を行う。３．マウスおよびAC細胞の分泌顆粒膜上におけるZnT4の局在を明らかにする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１．70週まで維持したヘテロlmマウスの顎下腺を摘出し、加齢による形態変化を検討したところ、マクロ所見及びHE染色において野生型マウスとlmヘテロマウスの顎下腺にはサイズ、形態に変化はみられなかった。また、顎下腺の発生過程におけるマウスZnT4遺伝子(mZnT4)の発現量に関しては唾液腺形成初期では発現量が低く、形成後期では徐々に発現量が上昇し、成獣で成獣で最も高いことが示された。以上のことから、発生・形態形成時および加齢におけるZnT4の遺伝子発現量、形態形成にはZnT4が主要な役割を担っていない可能性が示され、研究テーマとして成獣に限定した解析を行う必要があることが明らかとなった。
２．AC細胞のタンパク質分泌機能の検討の結果、β受容体刺激薬であるイソプロテレノールおよびcAMPアナログのジブチリルcAMPを用いても、濃度依存性、時間依存性のどちらも細胞外へのアミラーゼ、ムチン7分泌を誘導しなかった。本細胞にはアミラーゼ分泌顆粒が存在することが報告されていたが、開口放出性の細胞外への分泌を誘導することは困難であることが示唆された。AC細胞はタンパク質分泌能は有さないがタンパク質合成能を保持していることが明らかとなった。このことから、生理機能の検討は困難だが、分泌顆粒のZnT4を解析するには有用である可能性が考えられた。
これらのことから唾液腺におけるZnT4の遺伝子発現は成獣で高く、加齢によって形態に変化は生じない無い可能性が示された。また、AC細胞は細胞内部の分泌顆粒を用いた形態観察に有用であるが、外分泌機能の検討を行うにはさらなる条件検討が必要である可能性が示された。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．ホモlmマウスと野生型マウスの顎下腺における形態変化の検討を行う。
lmホモマウスを野生型と同様に飲水や食餌に亜鉛を添加しない状態で維持したとき、乳腺の形態に異常が生じることが報告されている(2015, Am. J. Physiol)。本年度は非亜鉛添加の飲水でlmマウスを維持し、唾液腺に形態異常が生じるかを明らかにする。
２．AC細胞に代わりマウス顎下腺初代培養細胞を行い、RNAiによる形態変化および亜鉛分泌能の検討を行う。
マウス顎下腺初代培養をAC細胞の代わりに用い、ウィルスベクターによるshRNAを行った時の形態変化および亜鉛分泌能の検討を行う。ウィルスベクターの選出は完了しており、本年度はベクターの精製と初代培養細胞への応用を行う。
３．マウスおよびAC細胞の分泌顆粒膜上におけるZnT4の局在を明らかにする。
AC細胞については、ZnT4過剰発現細胞に対する多重免疫蛍光染色を行う必要があり、有用な抗体の選出を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
抗体の使用方法を変更したことでロスを軽減できたため、使用額減となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
消耗品として物品費に全額を計上する。
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