ヒトiPS細胞を用いた低酸素培養による基礎的研究

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K20407
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 杉本 浩司 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (40646113)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: ヒトiPS細胞 / 低酸素 / HIFs

研究実績の概要

まず、４遺伝子と３遺伝子導入ヒトiPS細胞を用いた低酸素培養下での細胞増殖における影響について検討を行った。低酸素濃度(5%)および通常酸素濃度(20%)でヒトiPS細胞を培養し、ALP染色を行いコロニーの形成数を測定した。その際、5日目、14日目にて染色されたコロニー数の測定を行った。この結果、低酸素培養を行ったヒトiPS細胞は、通常酸素濃度で培養を行った細胞と比較して、細胞増殖が有意に促進されていた。
続いて、細胞に対する酸素供給が不足状態に陥った際に誘導されてくるタンパク質で、転写因子として機能しているHIFsのiPS細胞における働きについて検討を行った。siRNAを用いて、HIF1α、２α、３αをそれぞれノックダウンし、低酸素濃度下で４遺伝子と３遺伝子導ヒトiPS細胞の培養を行った。この際、ノックダウン7日目におけるコロニー形成数を、ALP染色し、計測した。この結果、HIF1αをノックダウンした細胞群では対照群と比較して、コロニー形成数に有意な差は認めなかった。それに対して、HIF２αおよびHIF３αをノックダウンした細胞群では、対照群で比較して、コロニー形成数は有意に減少していた。
以上の結果より、低酸素培養を行うことで、通常酸素濃度で培養するよりもヒトiPS細胞のコロニー形成は促進されること、低酸素培養においてHIF２αならびにHIF3αがヒトiPS細胞のコロニー形成、増殖に関与していることが考えられる。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

理研より購入したヒトiPS細胞の通常酸素濃度での培養において、最初に細胞を起こす段階で細胞の生存率が低く、予定したとおりに細胞を増殖させることができなかったこと。さらに、当研究室で凍結したヒトiPS細胞を再度融解した場合の、生存率も低かったことが、研究の遅延につながっている。

今後の研究の推進方策

今後、通常酸素濃度および低酸素培養したときのヒトiPS細胞の未分化マーカー(Nanog,Sox2,Oct4)の発現をリアルタイムPCR,Western blottingにて解析を行う予定である。また、低酸素環境下でsiRNAにてHIFsをノックダウンした場合の未分化マーカー(Nanog,Sox2,Oct4)の発現をリアルタイムPCR,Western blottingにて解析を行う。その際に、HIFsを複数同時にノックダウンしたときのヒトiPS細胞の動態についても検討を行う。

次年度使用額が生じた理由

27年度に予定していたリアルタイムPCRおよびWestern blottingまで行うことができなかったため。

次年度使用額の使用計画

次年度に、PCRプライマーおよびWestern blottingにて必要な抗体、消耗品を購入予定である。