2015 年度実施状況報告書

低分子量Ｇタンパク質Ｒａｃ１の新規四肢形成制御機構及び制御因子の解明

研究課題

研究課題/領域番号	15K20557
研究機関	昭和大学
研究代表者	斉藤芳郎昭和大学, 歯学部, 助教 (70611581)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2017-03-31
キーワード	Rac1
研究実績の概要	H27年度では肢芽未分化間葉系細胞で特異的にRac1を欠損させたRac1遺伝子コンディショナルノックアウトマウス（Rac1fl/fl;Prx1-Cre）を作成し未分化間葉系細胞の段階（胎生12日齢）で四肢の採取を行い細胞レベルでの検討を行った。採取した四肢細胞を高密度培養を行い培養０日、３日、５日で細胞の分化・増殖の検討を行った。その結果コントロール群（Rac1をノックアウトしていない細胞）に対しRac1をノックアウトした細胞では有位な細胞増殖の低下が認められた。また、軟骨の形成をAlcian blue染色を用い確認したところコントロール群とRac1をノックアウトした細胞ともに軟骨の形成が認められた。軟骨分化に対し定量的PCR法を用い軟骨細胞特異的な遺伝子（Aggrecan,Col2,Col10,SOX9）の発現量を検討した結果、分化に違いは認められなかった。軟骨培養を５日行ったのちβグリセロリン酸を添加した石灰化培地に変更し培養を行った。その結果コントロール群に対しRac1をノックアウトした細胞の石灰化が促進されたことをVonKossa染色にて確認した。また、定量的PCR法を用いて骨芽細胞特異的な遺伝子（ALP,RUNX2,OSX）の発現量を検討した結果、Rac1をノックアウトした細胞で優位に発現量が増加した。以上より肢芽未分化間葉系細胞でRac1遺伝子を欠損させたコンディショナルノックアウトマウス（Rac1fl/fl;Prx1-Cre）の肢芽細胞を用いた細胞培養系では、Rac1は細胞の増殖能を制御する因子であることが分かった。また、軟骨細胞の石灰化段階においては石灰化を促進させることが分かった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由肢芽未分化間葉系細胞で特異的にRac1を欠損させたRac1遺伝子コンディショナルノックアウトマウスを作成し未分化間葉系細胞の段階（胎生12日齢）で四肢の採取を行い細胞レベルでの検討を行ったところ、軟骨形成段階においてRac1が間葉系細胞の増殖能へ関与していることが示唆された。これはIn vivoで認められた長管骨成長板で認められた軟骨組織の形成・成熟異常の再現性が得られた可能性が示唆される。また、細胞培養系においてβグリセロリン酸を添加した石灰化培地で培養した結果、Rac1をノックアウトした細胞において石灰化が促進することが認められた。これよりRac1は間葉系細胞、軟骨細胞において石灰化を抑制するシグナルのスイッチ遺伝子として働いている可能性が示唆された。これらの結果より四肢形成、特に軟骨内骨化においてRac1遺伝子が重要な働きに関与している可能性が見出された。
今後の研究の推進方策	肢芽未分化間葉系細胞で特異的にRac1を欠損させたRac1遺伝子コンディショナルノックアウトマウスをの胎生期および１日齢の四肢骨格標本をを作成し、骨・軟骨組織をAlizarinn redおよびAlcian blueで染色を行う。高密度培養で得られた細胞より精製したmRNAを用い、マイクロアレイ解析を行い、遺伝子の網羅的解析を行うことで、Rac1コンディショナルマウス肢芽（胎生12日齢）で発現に変化が認められる遺伝子の探索を行う。選定された遺伝子に関しては定量的PCR法を用いて再現性を検討する。マイクロアレイで選定された候補遺伝子の軟骨細胞および間葉系細胞に対する作用を、アデノウイルスベクターによる強制発現、およびshRNAによるノックダウン法用いて検討する。胎生12日齢の培養肢芽細胞を様々な増殖因子・分化誘導因子で刺激した際の細胞増殖に対する影響、および分化誘導に対する影響を検討する。
次年度使用額が生じた理由	マイクロアレイによる網羅的遺伝子解析を次年度に行うこととしたため。
次年度使用額の使用計画	マイクロアレイを用いてRac1コンディショナルノックアウトマウスの肢芽細胞の遺伝子変異を網羅的に解析することとする。