2016 年度実施状況報告書

S. mutansのバイオフィルム形成におけるストレス応答メカニズムの解明

研究課題

研究課題/領域番号	15K20590
研究機関	岡山大学
研究代表者	八十川友紀 (松三友紀) 岡山大学, 大学病院, 助教 (90732800)
研究期間 (年度)	2016-04-01 – 2018-03-31
キーワード	Streptococcus mutans / バイオフィルム / シャペロンタンパク
研究実績の概要	Streptococcus mutansは、高い耐酸性を有しているため、口腔内の低いpH環境の中でもバイオフィルムを形成し続けることが可能である。その耐酸性にはS. mutansの表層タンパクと低pHを感知するシグナル受容体が機能していると考えられている。特に耐酸性は、S. mutansのシグナル伝達システムの中でも重要な因子であると思われるが、その詳細については不明な点が多い。S. mutansの病原性はすでに表層タンパクであるグルカン合成酵素 (GTF) およびグルカン結合タンパク (Gbp)であることが知られている。このうち、GbpAを欠失させた変異株を作製し、GTFをコードするgtf遺伝子の発現を調べたところ、gtfB遺伝子の発現が上昇することが明らかとなった。このことから、バイオフィルム形成量が増加し、バイオフィルムの構造においては、親株と比較して明らかに高さが上昇していた。さらに、耐酸性に関与するシャペロンタンパクDnaKおよびGroELをコードする遺伝子dnaKおよびgroELの発現も同様に上昇していた。これらのタンパクはストレス応答タンパクであることが報告されており、他のタンパクすなわちGbpAが欠失するという細菌にとってのダメージを修復するためにこれらのタンパクの発現が上昇し、結果としてgtfB遺伝子の発現に影響を与えたと考えられる。以上のことから、今後は、DnaK欠失変異株およびGroEL欠失変異株を作製することにより、これらのタンパクとGTFの発現との関連を検討する。さらにストレス応答メカニズムを明らかにするとともに、これらのS. mutansの耐酸性に関連する表層タンパクおよびそれらの発現を誘導するシグナル受容体を特定し、S. mutansの耐酸性誘導メカニズムについても解明する予定である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由出産、育児休暇のため。
今後の研究の推進方策	シャペロンタンパクDnaKおよびGroELの発現状態の違いによるバイオフィルム形成能およびその他の表層タンパクの発現に与える影響を調べ、タンパクの機能について明らかにする。DnaKおよびGroELの発現に影響を与えるシグナルおよびシグナル受容体についてスクリーニングを行う。得られたシグナルによるDnaKおよびGroELの発現の変化およびシグナル受容体との発現メカニズムの解析を行う。 1. dnaKおよびgroEL遺伝子の過剰発現株および発現抑制株の作製を行う。また同時にシャトルベクターを用いて発現抑制株における相補株を作製する。2. 二次元電気泳動システムを用いて、タンパク発現の比較を行う。3. Real-time Reverse Transcription Polymerase-Chain Reaction法にて、S. mutans　MT8148と各発現変異株による表層タンパクの遺伝子発現の解析を行う。4. バイオフィルム形成量および構造の検討を行う。形成量については、プレート底面に作製されたバイオフィルムを染色し、吸光度を比較検討する。構造については、蛍光ラベルした菌体と糖を用いたバイオフィルムを共焦点レーザー顕微鏡にて観察する。5. DnaKおよびGroELの発現に影響を与えるシグナルを検討する。低pH、好気培養、浸透圧、抗生物質を変化させた状態でS. mutansの培養した後、mRNAを抽出し、それらを用いてdnaKおよびgroEL遺伝子の発現量を決定する。6. シグナル受容体とdnaKおよびgroEL遺伝子との結合を検討する。まずS. mutansの全ゲノム配列よりシグナル受容体と推定される遺伝子を抽出する。それらのリコンビナントタンパクを作製し、ゲルシフトアッセイを用いて検討する。これらの分析において、これまでに他のタンパクについて行っており、予定通り実施できる。
次年度使用額が生じた理由	出産、育児休暇により、研究に遅れが生じているため。
次年度使用額の使用計画	シャペロンタンパクDnaKおよびGroELの発現状態の違いによるバイオフィルム形成能およびその他の表層タンパクの発現に与える影響を調べ、タンパクの機能について明らかにする。 1. dnaKおよびgroEL遺伝子の過剰発現株および発現抑制株の作製を行う。2. 二次元電気泳動システムを用いて、タンパク発現の比較を行う。3. Real-time Reverse Transcription Polymerase-Chain Reaction法にて、S. mutans　MT8148と各発現変異株による表層タンパクの遺伝子発現の解析を行う。4. バイオフィルム形成量および構造の検討を行う。5. DnaKおよびGroELの発現に影響を与えるシグナルを検討する。6. シグナル受容体とdnaKおよびgroEL遺伝子との結合を検討する。