| 研究課題/領域番号 |
15K20610
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
伊藤 龍朗 日本大学, 松戸歯学部, 助教 (60635126)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 小児歯科学 / バイオフィルム / SspBペプチド |
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| 研究実績の概要 |
小児う蝕の減少および軽症化傾向の一方で、歯周疾患における低年齢での増加傾向が近年問題視されている。歯周疾患をはじめとする口腔内感染症は、口腔細菌により形成され た生態系:バイオフィルム(B.F.)に起因しており、ペリクルや口腔粘膜へ細菌が付着することから始まる。また、口腔内B.F.は薬剤耐性遺伝子のリザーバーであり、従来の殺菌的・静菌的な制御法とは異なる新規B.F.制御法の確立が望まれている。そこで申請者は、付着の阻害という新たなアプローチの着想に至った。本研究ではSspB相同ペプチドを利用し、SspB-歯周病原性細菌-ヒト唾液の三者間における相互作用をin vitroにて検証し、成果をまとめた。
(1) ヒト唾液(濾過滅菌済み)を被覆したELISAプレートに、ビオチン化SspB相同ペプチドを処理した。ペプチドの濃度は、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/mlの四段階で検討した。アルカリフォスファターゼによる発色反応をプレートリーダー (405 nm)にて解析する事で、 SspB 相同ペプチドがヒト唾液と反応する至適濃度を選別した。
(2) 口腔細菌叢のバランスの変化は日和見感染を引き起こしかねないため、SspB相同ペプチドによるP. gingivalisのMfa1線毛への特異的結合（SspB-Mfa1相互作用）を検証する必要がある。よって、P. gingivalis ATCC33277株、P. gingivalis W83株に加え、F. nucleatum、A. actinomycetemcomitansを供試菌として用いた。炭酸バッファーに懸濁した供試菌液 (OD600=0.4) をELISAプレートに分注し、SspB 相同ペプチドとの反応を解析した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究成果を論文としてまとめ国際学術誌へ投稿したが、査読者からより精緻なデータが必要である旨、意見があり、追加実験の必要性が生じた。現在追加実験を実施しているところであるが、凍結保存していた菌株を実験当時のコンディションにまで生育させることが困難であったため、想定以上の時間を要している。
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| 今後の研究の推進方策 |
P. gingivalis (Pg) のB.F.形成量はS. gordonii (Sg) 存在下で顕著に増加することから、SspB-Pg間の相互作用がキーになると考えられている。
（１）NOD/SCID.e2f1-/-マウスのメス(12 週齢)を、①Sg感染群、②Pg感染群、③偽感染群、④Sg+Pg感染群、⑤Sg+SspB 相同ペプチド+Pg感染群の 5 群に分ける。抗菌剤(ST 合剤)を飲料水に 添加し、10 日間抗菌処理を行う。ヒト唾液をマウス歯面に処理した後、①群には Sg (1×109 CFU/ ml) 100μlを②群にはPg (1×107 CFU/ ml) 100μlを経口投与により感染させる。③群はPBSを経口投与する。Sgの定着確認後、④群にPg (1×107 CFU/ ml) 100μl接種する。⑤群には、SspB 相同ペプチド経口投与後、Pgを接種する。感染から 7 週後に顎骨標本を作製、上顎頬側の歯槽骨頂～セメント-エナメル境間を計測し、５群間の骨吸収の程度を比較する。（２）超音波処理により顎骨から菌を回収し定量することで、５群間の菌量を比較する。
３カ年で得られた結果を総括し、成果の発表を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究成果を論文としてまとめ国際学術誌へ投稿したが、査読者からより精緻なデータが必要である旨、意見があり、追加実験の必要性が生じた。現在追加実験を実施しているところであるが、凍結保存していた菌株を実験当時のコンディションにまで生育させることが困難であったため、想定以上の時間を要している。そのため当初予定していたB.F.細菌数の定量を、次年度に行うこととした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
追加実験に用いるペプチド合成料に助成金を充てる。さらに、次年度に延期したB.F.細菌数の定量を行うため、定量PCR用の試薬購入に充てる。
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