| 研究課題/領域番号 |
15K20868
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
菅原 雅之 東北大学, 生命科学研究科, 助教 (90742776)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 根粒菌 / タンパク質分泌機構 / 共生 / ダイズ |
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| 研究実績の概要 |
根粒菌3型分泌タンパク質が及ぼすマメ科植物との共生不和合性の分子機構を明らかにすることは、植物と根粒菌の共生進化の理解と、優良根粒菌を利用した効率的な作物生産への応用において重要な知見を与えることが期待される。本課題では昨年度までに、Rj2遺伝型ダイズに対して共生不和合性を誘導する根粒菌USDA122株の原因３型エフェクターBD122_09010遺伝子産物を同定した。また和合性を示すUSDA110株との間に見られる4つの構成アミノ酸残基の相違が、Rj2遺伝型ダイズに対する表現型を決定することを示した。平成29年度では、共生不和合性を決定するアミノ酸残基を絞り込むため、その4つのアミノ酸残基を標的としたアミノ酸置換根粒菌株を作製した。それらのRj2ダイズへの根粒形成における影響を評価した結果、ヒスチジンあるいはアルギニンの3残基が共生不和合性の誘導に必須であることを明らかにした。これらアミノ酸の根粒菌細胞内におけるリン酸化を調査した結果、細胞内に分泌されるBD122_09010遺伝子産物のリン酸化されていないことが明らかとなった。以上の結果は、２つの国内学会にて報告し、現在国際誌に投稿中である。さらに分子機構の解明を進めるため、BD122_09010遺伝子産物の立体構造と、ダイズ側の原因タンパク質との相互作用を解析することを目的として、大腸菌発現系にて大量精製した。来年度は精製タンパク質を利用して、ダイズ側の因子との相互作用について検討を行っていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
３型分泌機構の共生機能について、昨年度までにRj2ダイズに対して共生不和合性を誘導する根粒菌USDA122株の原因３型エフェクターとしてBD122_09010遺伝子産物を同定し、和合性を示すUSDA110株との間に見られる4つの構成アミノ酸残基の相違が、Rj2遺伝型ダイズに対する表現型を決定することを示した。平成29年度では、共生不和合性を決定するアミノ酸残基の特定を目的として、その4アミノ酸残基を標的とした全16種類のアミノ酸置換根粒菌株を作製した。これらの接種によるRj2ダイズ品種Hardeeの根粒形成における影響を評価した結果、ヒスチジンあるいはアルギニンの3残基が共生不和合性の誘導に必須であることを明らかにした。本年度の計画の１つの目標を達成できた。ヒスチジンとアルギニンはそれぞれ原核細胞内においてリン酸化されるアミノ酸であることから、細胞外に分泌されるBD122_09010遺伝子産物のリン酸基修飾について検討した。リン酸化タンパク質の検出に有効なPhos-tagアクリルアミドとBD122_09010遺伝子産物抗体を組み合わせたウエスタン解析において、リン酸化は認められず、当該タンパク質は根粒菌細胞ではリン酸化しないことが明らかとなった。ここまでの成果について論文を執筆し、現在国際論文誌に投稿中である。
次に、当該タンパク質の立体構造とダイズ側の原因タンパク質との相互作用を検討するため、大腸菌発現系におけるBD122_09010遺伝子産物の精製を試み、Ni-NTAアフィニティ精製、イオン交換カラム精製、およびゲルろ過過程を経ることでタンパク質の精製に成功した。したがって、目標としていたタンパク質間相互作用機構の解明までは至っていないが解析への準備ができたと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) 根粒菌３型タンパク質分泌機構が及ぼす共生不和合性の分子機構
今後は精製BD122_09010タンパク質とダイズの原因タンパク質であるRj2タンパク質を等温滴定カロリメトリー法に供し、両者の直接的な相互作用について検討する。その結果において直接的な相互作用が認められなかった場合には、BD122_09010遺伝子産物と相互作用を行うダイズ因子の同定をダイズ根の抽出液とのプルダウン解析により行う。また、USDA122株による共生不和合性が根粒形成のいずれの段階で誘導されるのかを顕微鏡観察にて決定する。
（２）ダイズ根粒菌の６型分泌機構が示す宿主植物との共生相互作用における役割の解明
ダイズ根粒菌の６型分泌機構の機能有無を検出するため、野生株および遺伝子破壊株の培養液におけるHcpエフェクターの検出を行う。また、根粒菌が６型分泌系を保有する意義について調査するため、ダイズ根圏における競合能および生残性について検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の成果をまとめた投稿論文が受理されていないことから、予定していた掲載料の支払いが終わっていないため、次年度使用額が生じた。受理され次第、掲載料として使用する。
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