全自動１細胞解析単離装置による大規模嗅覚受容体レパトア解析

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 15K21068
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 良元 伸男 大阪大学, 産業科学研究所, 特任准教授 (80467612)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: １細胞解析 / 嗅覚細胞 / 嗅覚受容体 / 匂い分子 / 嗅覚受容体レパトア / バイオセンサー / 全自動１細胞解析単離装置

研究実績の概要

本研究では全自動1細胞解析単離装置を用いたタイムラプス解析向けに、特に１）細胞への侵襲性の検定、２）新灌流系を用いた新たな匂い分子のORスクリーニング、３）目的細胞検出の更なる高感度化を行った。１）CHO細胞をモデルに用いて１細胞からの増殖試験を行った。詳細には抗体分泌CHO細胞１個が分泌する抗体を個々の細胞周辺に非侵襲的に固定化してFIA方式で定量検出する系（CS-FIA、木田ら、Anal. Chem. 85, 1753-9（2013））を用い、全自動１細胞解析単離装置を用いて陽性細胞を１細胞ずつ単離して増殖させた。結果、45個の細胞から37個（82%）の増殖が確認できた。これにより嗅覚細胞への低侵襲性が示唆され、ORスクリーニング成功率の１つの要素となると考えられた。２）新作の解析エリアを広げたORスクリーニングを実施した。匂い分子に加齢臭の成分であるnonenal（30、300 μM）を用いて嗅細胞群を刺激した。アッセイした約10,000細胞の内nonenalに反応した細胞は71個（nonenal 両濃度でのアッセイ総計）と検出され、内反応の良い細胞11個を回収し１細胞RT-PCRに供した。３個についてPCRに成功し、解析の結果OlfR156、262、877が同定された。３）新しい低バックグラウンドのマイクロチャンバーアレイチップを開発するべく、基板（ガラス、テンパックス、石英）上にSU8光硬化樹脂を塗布し、18 ~ 20 μmの深さでウェルをパターンニングした。全自動１細胞解析単離装置を用いて5、50、100 msecの露光時間で樹脂を塗布した基板の自家蛍光を観察したところ、いずれもRFU（0 ~ 255）< 10を示し、現行のPSスライド（RFU = 30程度）より低い値を示した。これは新作チップの方が低バックグラウンドであり、相対的に感度が改善されることを示す。

研究成果

• [雑誌論文] High-Throughput Analysis of Mammalian Receptor Tyrosine Kinase Activation in Yeast Cells (2016)
  • 著者名/発表者名: Nobuo Yoshimoto, Shun'ichi Kuroda
  • 雑誌名: Methods in Molecular Biology pp 巻: 1487 ページ: 35-52
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-6424-6_3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cellular uptake of hepatitis B virus envelope L particles is independent of sodium taurocholate cotransporting polypeptide, but dependent on heparan sulfate proteoglycan (2016)
  • 著者名/発表者名: Masaharu Somiya, Qiushi Liu, Nobuo Yoshimoto, Masumi Iijima, Kenji Tatematsu, Tadashi Nakai, Toshihide Okajima, Kazuyuki Kuroki, Keiji Ueda, Shun’ichi Kuroda
  • 雑誌名: Virology 巻: 497 ページ: 23-32
  • DOI: 0.1016/j.virol.2016.06.024
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] RBM20 and RBM24 cooperatively promote the expression of short enh splice variants (2016)
  • 著者名/発表者名: Jumpei Ito, Masumi Iijima, Nobuo Yoshimoto, Tomoaki Niimi, Shun'ichi Kuroda, Andres D. Maturana
  • 雑誌名: FEBS Letter 巻: 590 ページ: 2262-2274
  • DOI: 10.1002/1873-3468.12251
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Mutational analysis of hepatitis B virus pre-S1 (9-24) fusogenic peptide (2016)
  • 著者名/発表者名: Qiushi Liu, Masaharu Somiya, Naohiko Shimada, Wakako Sakamoto, Nobuo Yoshimoto, Masumi Iijima, Kenji Tatematsu, Tadashi Nakai, Toshihide Okajima, Atsushi Maruyama, Shun'ichi Kuroda
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 474 ページ: 406-412
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.04.125
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Scaffold protein enigma homolog 1 overcomes the repression of myogenesis activation by inhibitor of DNA binding 2 (2016)
  • 著者名/発表者名: Miyuki Nakatani, Jumpei Ito, Riko Koyama, Masumi Iijima, Nobuo Yoshimoto, Tomoaki Niimi, Shun'ichi Kuroda, Andres D. Maturana
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 474 ページ: 413-420
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.04.119
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Bio-nanocapsule-based scaffold improves the sensitivity and ligand-binding capacity of mammalian receptors on the sensor chip (2016)
  • 著者名/発表者名: Masumi Iijima, Nobuo Yoshimoto, Tomoaki Niimi, Andres D. Maturana, Shun'ichi Kuroda
  • 雑誌名: Biotechnology Journal 巻: 11 ページ: 805-813
  • DOI: 10.1002/biot.201500443
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Bio-nanocapsules displaying various immunoglobulins as an active targeting-based drug delivery system (2016)
  • 著者名/発表者名: Kenji Tatematsu, Masumi Iijima, Nobuo Yoshimoto, Tadashi Nakai, Toshihide Okajima, Shun’ichi Kuroda
  • 雑誌名: Acta Biomaterialia 巻: 35 ページ: 238-247
  • DOI: 10.1016/j.actbio.2016.02.010
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cytokine-dependent activation of JAK-STAT pathway in Saccharomyces cerevisiae (2016)
  • 著者名/発表者名: Nobuo Yoshimoto, Yuko Ikeda, Kenji Tatematsu, Masumi Iijima, Tadashi Nakai, Toshihide Okajima, Katsuyuki Tanizawa, Shun'ichi Kuroda
  • 雑誌名: Biotechnology and Bioengineering 巻: 113 ページ: 1796-1804
  • DOI: 10.1002/bit.25948
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] Decipherment of olfactory receptor repertoire by using an automated single-cell analysis and isolation system (2016)
  • 著者名/発表者名: Nobuo Yoshimoto, Masato Suzuki, Akiko Kida, Ken Shimono, Shun'ichi Kuroda
  • 学会等名: The 20th ISIR International Symposium
  • 発表場所: 大阪府大阪市
  • 年月日: 2016-12-12 – 2016-12-13
  • 国際学会
• [学会発表] 細胞表層FIAとイムノチャンバーを用いる１細胞育種法の開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 良元伸男、黒田俊一
  • 学会等名: 第68回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 富山県富山市
  • 年月日: 2016-09-28 – 2016-09-30
• [図書] AROMA RESEARCH No.67 「特定の匂い分子に応答する嗅覚受容体群の網羅的取得法」 (2016)
  • 著者名/発表者名: 良元伸男、黒田俊一
  • 総ページ数: 6
  • 出版者: フレグランスジャーナル
• [備考] 生体分子反応科学研究室
  • URL: http://www.sanken.osaka-u.ac.jp/labs/smb/index.html