|
これまでの結果から、TCRb遺伝子再構成の制御にはコヒーシンが必須ではないことが明らかになった。そこで、TCRb遺伝子の染色体高次構造変化を司る因子として、既にTCRb遺伝子の再構成を制御することが明らかになっている転写因子を新たな候補として研究を展開することにした。Rag2KOマウスのDN胸腺細胞をTSt4/DLL4ストローマ細胞上で培養するin vitro系を用いて、レトロウイルスベクターを用いて候補転写因子のノックダウンを行うことで、TCRbの染色体構造を定量的に解析した。具体的には、染色体上のTCRbのVとDJ領域を検出するプローブを使用して3D-DNA FISHを実施し、高解像度顕微鏡で撮影したT細胞の核ごとの画像を核内ゲノム構造解析プログラム(TANGO)を使用してVとDJ領域の距離を計測した。その結果、T細胞分化に重要であることが知られているE2Aのノックダウンにより、TCRbのVとDJ領域の距離が離れることが明らかになった。これまでの報告によりDN胸腺細胞において、TCRbのVとDJ領域が接近し、遺伝子再構成が抑制されるDP胸腺細胞ではVとDJ領域が離れることが明らかになっており、DN胸腺細胞でVとDJ領域が接近することが再構成に重要であると考えられている。従って、E2AはDN胸腺細胞においてTCRbのVとDJ領域を接近させることでTCRbの遺伝子再構成を制御する可能性が考えられた。E2AによるTCR遺伝子の染色体構造の制御機構についてさらに詳細に調べるため、免疫染色と3D DNA FISHを組合せたImmuno-FISH法を用いて、核内のE2Aの局在とTCRbのVとDJ領域の距離の関係について現在解析を進めている。
|
