| 研究課題/領域番号 |
15K21295
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
柳澤 幸子 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (60557982)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 呼吸鎖超複合体 / ミトコンドリア / 呼吸鎖電子伝達系 / チトクロム酸化酵素 / 振動分光法 |
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| 研究実績の概要 |
ミトコンドリア呼吸鎖電子伝達系末端にあるチトクロム酸化酵素(CcO)は、蛋白質を取り巻く環境の変化が蛋白質内部にある活性中心の電子状態に影響する事を明らかにしてきた。一方、呼吸鎖複合体が一定比率で集合した「超複合体」の電子顕微鏡構造解析像は、超複合体中CcOの構造が単離精製した結晶中とは異なる事が他者のこれまでの研究により報告され、最近では4オングストローム分解能の構造が報告された。本研究では呼吸鎖超複合体形成がCcOの活性中心の電子状態にどのような影響を与えるのか、振動分光法により調べ、呼吸鎖超複合体形成の意義を化学反応性の観点から明らかにする事を目的としている。具体的には、CcOについて、単独で存在する場合と超複合体形成時のそれぞれで共鳴ラマンスペクトルを比較し、活性中心であるヘムの電子状態に違いがあるか調べる。H27年度は還元型超複合体のラマンスペクトルの測定条件の検討を行い、測定を通して超複合体が形成されたままで、かつ、ラマンスペクトルが測れる波長や溶液の条件を決定した。H28年度においては、ラマン分光器を変更した上で高分解能での測定をし、解析を行った。CcO中の酸素結合部位であるヘム鉄は、還元型では５配位状態で存在し、軸配位子であるHisとの結合強度の違いが酸素の親和性の違いを反映する事が知られている。本研究では1.7メガダルトン相当という非常に大きな超複合体の中のたった一つのヘム鉄とHisとの結合を検出する事に成功し、この結合に由来するラマンバンドの振動数は測定した分解能では誤差範囲内で違いはなく、すなわち超複合体形成は完全還元型における酸素親和性に影響しないことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H27年度において還元型試料について、可視共鳴ラマンスペクトルの測定条件及び、参照試料であるCcOモノマーと超複合体構成成分混合液の調製法を確立したので、H28年度はラマン分光器を変更してラマンスペクトルの分解能を高くし、超複合体、構成成分混合液、およびCcOモノマーの三つの異なる条件中のCcOの共鳴ラマンスペクトルに差異があるのかどうかを調べた。特に酸素が結合する鉄イオンと直接結合しているヒスチジン残基の結合強度を示すFe-His伸縮振動について、高分解能での測定であっても誤差の範囲内でその振動数が一致することが明らかとなった。一方で、超複合体中に８つのヘムがあり、その中からCcOのヘムそのものの振動モードについて検出するのは非常に困難であることがわかった。異なる複数の励起波長での測定や状態を変える実験を取り入れることがバンドの帰属に必要と考えられる。また、基質である酸素分子の代替物として一酸化炭素を結合させた場合のラマンスペクトルの測定条件を検討した。COは光によってヘム鉄から乖離する性質があり、CO型CcOの極大波長のレーザー光照射は最も光乖離をおこしやすいが、一方で得られるCOが関与するラマンバンドの相対的強度が最も大きい。H28年度において、CO型超複合体の調製法を確立し、複数のレーザー波長でラマンスペクトルを測定した。その結果、励起波長に430 nmのパルスレーザーを用いて目的のバンドが十分な強度で得られることがわかった。また、ラマン励起レーザーとしてCO型CcOの極大波長で、なおかつパルスレーザーを用いるために、CO光乖離と試料の損傷を防ぐ線集光系へと改良し、さらにセルのラマンバンドの検出を避けるために肉厚が極めて薄いラマンセルを用いることで目的の測定条件を達成した。
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| 今後の研究の推進方策 |
CO型試料について、可視共鳴ラマンスペクトルの測定条件を確立したので、今後は、超複合体、構成成分混合液、およびCcOモノマーの三つの異なる条件中のCO結合型CcOの共鳴ラマンスペクトルに差異があるのかどうかを明らかにする。特にヘム鉄とそこに結合したCOの伸縮振動に由来するFe-CO伸縮振動に違いがあるのか、また、結合したCOそのものの振動モードであるC-O伸縮振動に違いがあるのか、それらのラマンバンドを比較して検討する。必要に応じてフィッティングや異なる励起波長でのスペクトルを得て解析をする。
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