| 研究課題/領域番号 |
15K21323
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| 研究機関 | 獨協医科大学 |
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研究代表者 |
竹井 元 獨協医科大学, 医学部, 助教 (00708183)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 哺乳類精子 / 受精能獲得 / NCX / NKA / Na+ |
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| 研究実績の概要 |
細胞外のイオンや浸透圧環境が哺乳類精子の受精能獲得に与える影響を明らかにするために、ハムスター精子を用いて研究を行っている。本課題採択前までの研究により、細胞外のNa+イオン濃度がハムスター精子超活性化の発現の速さに影響を与えることが分かっており、その調節にNa+/Ca2+ exchanger (NCX)が関わっている事が示唆されている。本課題ではその制御機構を明らかにすることで超活性化発現調節機構の一端を解明することを目的とした。
本年度に予定していた研究計画のうち、超活性化運動の発現鞭毛軸糸タンパク質のチロシンリン酸化の解析及びCa2+イメージングを行った。その結果、細胞外Na+による超活性化調節では、従来知られていた軸糸タンパク質のチロシンリン酸化を介さないシグナル経路を経ていることが分かった。またCa2+イメージングの結果、細胞外のNa+が増加するのに従い、先体部のCa2+濃度は変わらないのに対して鞭毛内のCa2+濃度が減少することが分かった。更に鞭毛運動解析の結果から、超活性化前の鞭毛運動に対しても細胞外Na+が抑制的な効果を示し、その制御機構は超活性化とは異なることが分かった。
また、計画にはなかったが細胞外Na+による超活性化調節に関わる膜タンパク質の候補として、Na+/K+ ATPase (NKA)の関与を阻害剤であるouabainを用いて調べた。その結果、ouabainがNKA α4サブユニットを特異的に阻害する濃度で、鞭毛運動には影響を与えずに超活性化運動の発現を抑制することを明らかにした。更に細胞外Na+濃度を薄くすることでouabainの阻害効果が弱まることが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度に予定していた研究計画のうち、軸糸タンパク質のチロシンリン酸化の解析及びCa2+イメージングの一部しか完了しなかった。しかし、代わりに細胞外Na+が運動開始から1.5時間後までの鞭毛運動波形へ影響を与えることを明らかにし、この制御は超活性化とは別の経路を介していることを明らかにし、そこまでの内容をまとめた論文を投稿できた。また、細胞内外のNa+ホメオスタシスを調節する主たる分子であるNKAの活性が、ハムスター精子超活性化運動発現に必須であるという予備的な結果を得ることができた。更に、予備実験によりマウス精子において細胞外NaClが鞭毛運動よりもむしろ体積調節や形態の維持に働いている事も示唆された。以上の成果より、研究全体の進捗としてはおおむね順調であると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
従来の予定通り、精子細胞に発現するNCXを同定し、その局在を明らかにすることを計画している。しかし市販の抗体を用いたウェスタンブロッティングでNCXを検出することはできなかったため、RNA-seqを用いてハムスター精巣で発現しているmRNAを網羅的に解析する事で、精巣で発現しているNCXはどのサブタイプかを調べる予定である。その後それぞれの分子についてクローニングを行い、抗体を作成しウェスタンブロッティングや免疫染色によりタンパクレベルでの解析を行う予定である。また27年度の研究によりNKAが哺乳類精子の受精能獲得に対し重要な働きを持つという興味深い結果が得られたので、並行してNKAの精子における機能解析も行う予定である。同時に、これらの分子がもう一つの受精能獲得に伴う重要なイベントである先体反応に影響を与えるのかどうかについても、それぞれの阻害剤を用いて調べる予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画では、細胞外Na+がハムスター精子超活性化や鞭毛運動に影響する内容をまとめた論文の投稿料や別刷りの料金に平成27年度の予算の一部を使用する予定であった、しかし、論文の受理までに想定以上の時間がかかり年度中に受理されなかったため、その分だけ若干の繰越金が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度中には受理されなかったものの、論文は投稿中であるため、受理された際には当初の予定通りその投稿料及び別刷りの料金に使用する予定である。
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