| 研究課題/領域番号 |
15K21373
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
田代 良彦 順天堂大学, 医学部, 助教 (20636245)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | マクロファージ / 単球 / plasmin / MMP-9 / 肝炎 / 血球貪食症候群 |
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| 研究実績の概要 |
本年度の研究で代表者らは、Toll like receptor-9 のアゴニストであるCpG-ODN1826とD-ガラクトサミンを使用し、急性肝炎を誘導するマウスモデルの作製に成功した。そして、そのマウスモデルにおいて、血液線維素溶解系 (線溶系)の主要な因子であるplasminおよびMMP-9といった各種のプロテアーゼの活性化を認めることが明らかになった。そこで、急性肝炎を始めとする各種炎症性疾患におけるこれらのプロテアーゼの活性化の意義・機能解析を行うため、plasminogen遺伝子欠損マウスおよびMMP-9遺伝子欠損マウスを使用し、急性肝炎マウスモデルを作製したところ、これらの遺伝子欠損マウスでは致死的な急性肝炎モデルにおいて有意な生存率の改善、および臓器組織の病理所見でも炎症の改善傾向を認めた。そこで、代表者らは、主要な線溶系因子であるplasminの新規阻害剤の投与による肝炎病態の制御を試みた。plasmin阻害剤の投与により、血中の各種炎症性サイトカイン濃度は抑制され、かつ生存率も有意な改善を認めた。その機序として、肝炎病態に関与する炎症性サイトカインの多くが、MMPの活性化に伴い、細胞外ドメイン分泌され、末梢血中へ産出されていること、そしてplasmin阻害剤がこのMMPの潜在型から活性型への変換を障害することで、炎症性サイトカインの血中濃度上昇を抑制し、致死的な病態の改善に寄与していることが示唆された。またplasmin阻害剤の投与により、肝臓・脾臓・骨髄への炎症性細胞の浸潤が有意に抑えられていることも判明した。その機序として、plasmin阻害剤が、MMPの活性化阻害だけでなく、mcp-1などの各種ケモカインの産生および活性化の抑制をもたらすことで、組織への炎症性細胞動員および浸潤が抑制されていることが考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では，急性肝炎モデルマウスおよび急性膵炎モデルマウスモデルマウスを作製することから始まり、それらに対して線維素溶解系（線溶系）因子群を制御することで、炎症性サイトカインおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）などの蛋白分解酵素の活性化調節を行い、最終的には実質臓器の炎症性疾患に対する新規治療法の開発までを目的としている. 実際の研究としては、サイトカイン分泌、タンパク分解酵素の活性機構の上流にある線溶系因子に着目し，Plasminogen (Plg)，MMP-9遺伝子欠損マウス（Plg-/-, MMP-9-/-）及びその野生型マウス(Plg+/+, MMP-9+/+, Wild) の各種マウスを用いて急性肝炎モデルを作製した．同様に，C57BL6/Jマウスを用いて，新規プラスミン阻害剤（YO-2）投与群と溶媒（PBS）投与群にわけて急性肝炎モデルマウスを作製した．その結果、Plasminogen (Plg)，MMP-9遺伝子欠損マウス（Plg-/-, MMP-9-/-）及びYO-2投与群においては、いずれも良好な結果が得られた。サイトカインに関してはELISA法による解析を行い、有意に低値を得られた。また、病理学的にも免疫染色を行い炎症性細胞浸潤の抑制効果を得る事ができた.
現在、以上の結果をもとに論文作製を行っている段階まで来ており、おおむね順調に進展していると考えられる.
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| 今後の研究の推進方策 |
急性肝炎モデルにおいて、plasminやMMP-9の産生および活性化を確認したが、そのトリガーとして血清中でuPAやtPAの増加を認めることを明らかにしたが、そのメカニズムに関しては詳細な検討が今後も必要である。細胞実験では、単球・マクロファージ系のcell line(RAW264.8)を用いて、TLR９を刺激することで、uPAやuPARの遺伝子発現が増加することが明らかになった。したがって単球・マクロファージ系の細胞が刺激され、その細胞周囲でplasminの活性化が起こっている可能性が示唆された。また細胞実験を通して、plasminが単球・マクロファージに作用して、TNFαやmcp-1などの遺伝子発現をより増強させる機序が明らかになったが、どのようにplasminの受容体とTLR9が関わっているかに関しては今後の課題である。またtPAの産生細胞としては血管内皮細胞などを想定しているが、tPAも急性肝炎の病態形成に寄与している可能性が十分に考えられる。
またplasmin阻害剤投与による副作用について検討を行ったが、急性肝炎モデルにおいては、明らかな血栓傾向の増悪などの所見は認めなかった。plasmin阻害剤の投与開始時期に関して、より早期からの介入が生存率の改善に寄与したが、その理由に関しては詳細な検討が必要である。以上、我々の実験からは線溶系の活性化を起点にした急性肝炎の進展の機序が示唆されたが、実際の急性肝炎の患者検体においてもそのような線溶系の活性化が見られるかどうか、また線溶系因子の活性化が病態形成に関わっているかどうかに関しては今後の課題としたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由としては、人件費および謝金が発生しなかったことや、実験結果がしっかりまとまるまでは発表を控るようにしたため、旅費が少なくなったことが挙げられる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
これらの金額と次年度以降に請求する研究費を合わせた使用計画としては、論文作成における翻訳への謝金に使用すること、また投稿後のreviseへの各種追加実験に使用すること、学会への旅費として使用することなどを計画している。
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