研究課題
がんなどの疾患でその発現量が上昇するとされるムチン糖蛋白質タイプ1 (MUC1) は、高度に糖鎖修飾された粘液性糖蛋白質で、その糖含量はその全分子量中、実に50%以上を占める。しかし、生体内MUC1糖鎖構造解析は現状の解析技術では困難であり、MUC1糖鎖を定量的に検出するには新たな方法論が必要とされている。本研究では、微量な生体試料 (組織切片) 由来MUC1の糖鎖プロファイリング法の確立と、MUC1産生腫瘍である膵・胆管がん多検体組織を用いてMUC1比較糖鎖プロファイリングを実施し、疾患特異的MUC1糖鎖の創出と新たな診断・治療標的薬開発への応用およびその腫瘍形成における腫瘍生物学的役割を明らかにすることを目的とする。MUC1 の高感度な比較糖鎖プロファイリング法確立のため、抗 MUC1 抗体、MY.1E12 を用いた免疫沈降およびレクチンマイクロアレイによる抗体オーバーレイレクチンアレイ解析法の最適化を実施する。最適化されたプロトコルに従い、MUC1 高値の疾患である胆管癌患者由来血清にて MUC1 比較糖鎖プロファイリングを実施した。組織切片由来 MUC1 の糖鎖プロファイリングへ向けて、MUC1 を高発現する胆管癌・膵臓癌組織切片を使用した。MY.1E12 染色による、組織中 MUC1 を高発現している箇所を選抜、レーザーマイクロダイセクションによる選択的な MUC1 発現組織断片を獲得した。最適化したプロトコルを応用しプロファイリングの取得を試み、プロファイリング取得可能な条件設定を実施した。
2: おおむね順調に進展している
MUC1 産生培養細胞株の培養上清を用いてプロトコルの最適化を実施した。MUC1 発現株・非発現株それぞれについて培養上清より MY.1E12 にて免疫沈降を実施し、沈降物をレクチンアレイに供し糖鎖プロファイリングの取得を試みたところ、MUC1 発現株のみに有意なレクチンシグナルを得た。よって本プロトコルが MUC1 糖鎖プロファイリング取得に有効であることが示された。次に、本プロトコルが血清中 MUC1 の糖鎖プロファイリングに応用可能かを検討したところ、健常者血清 5 μL より、MUC1 糖鎖プロファイルの取得が可能であった。さらに、胆管癌患者および胆道系良性疾患患者血清数十検体を用いて MUC1 比較糖鎖プロファイリングを実施したところ、癌患者特異的に上昇するレクチンを幾つか見出すことに成功した。ここで見出されたレクチンと MUC1 とを組み合わせた検出は、胆管癌診断に有効なマーカーとなることが期待されるものであり、抽出されたレクチンと MUC1 サンドイッチ ELISA による胆管癌マーカーの有用性を検証し、本成果については論文および学会にて発表を実施した (Matsuda A., Ana Chem. 2015, Yamaguchi T., Ann Surg Oncol. 2016)。組織切片を標的とした糖鎖プロファイリングは、MY.1E12 染色による胆管癌および膵臓癌の選別は終了し、レーザーマイクロダイセクションによる組織断片の取得およびタンパク質抽出、MY.1E12 による免疫沈降から MY.1E12-オーバーレイレクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイリング取得に必要な組織領域の見積もりを実施している。
28年度は、27年度に確立した MY.1E12-オーバーレイレクチンマイクロアレイによる比較糖鎖プロファイリング法を組織切片由来 MUC1 の比較糖鎖プロファイリングへと最適化する。27年度までに、プロファイリング可能な組織領域のおおよその見積もりは終了した。2.5 mm 平方の領域から取得可能であることがこれまでの検討で明らかとなっているので、この領域以上取得可能な検体を選別し、胆管癌および膵臓癌患者組織検体について順次 MUC1 プロファイリングの取得を実施する。共同研究先である鹿児島大学医学部病理講座にて膵臓癌 135 症例、胆管癌 63 症例を準備していただき、各症例について抗体オーバーレイレクチンアレイにて MUC1 糖鎖プロファイリングを実施する。取得したレクチンアレイデータは統計処理ソフトを使用して、胆管癌・膵臓癌の MUC1 で糖鎖プロファイルに有意な差が生じるか否かを検討する予定である。胆管癌・膵臓癌それぞれで特異的なレクチンが選抜された後、連続切片を使用して、先達されたレクチンおよび MY.1E12 による蛍光二重染色によって得られた結果の整合性を検証する。また、得られたレクチンシグナル値と、各臨床パラメータを比較することによって、胆管癌・膵臓癌それぞれで得られる MUC1 上の糖鎖プロファイルの推移と臨床学的有用性について検討を実施する予定である。
購入予定試薬の納期が期限までに間に合わなかったため
本年度の予算配分が決定次第、購入予定試薬を購入する予定である
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Annals of Surgical Oncology
巻: 23 ページ: 671-677
10.1245/s10434-015-4878-4
Analytical Chemistry
巻: 87 ページ: 7274-7281
10.1021/acs.analchem.5b01329
