| 研究課題/領域番号 |
15K21698
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| 研究機関 | 大阪府立公衆衛生研究所 |
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研究代表者 |
野村 千枝 大阪府立公衆衛生研究所, その他部局等, 研究員 (50393260)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 食中毒事件 / キノコ / 種特異的 / プライマー / 調理 / 人工胃液 / 迅速鑑別法 / ITS領域 |
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| 研究実績の概要 |
日本では毎年、有毒キノコの誤食による食中毒が数十件発生している。食中毒の原因究明のために行われるキノコの肉眼・顕微鏡観察による形態学的鑑別法は、高度な菌類学の専門知識を要する上、キノコが原形を留めていない食中毒検体（喫食残品や患者吐物）には適用が困難である。そこで、種の同定に有用とされるDNAバーコーディング法を応用し、DNAを標的とする迅速鑑別法の確立を目的とし研究を行った。
日本で食中毒事例のあるキノコのうち、5種類のキノコ（オオワライタケ、オオシロカラカサタケ、ニガクリタケ、スギヒラタケ、カキシメジ）について特異的なプライマーを作製した。これらのプライマーは調理および人工胃液による処理に影響を受けず、約2時間半で湿試料100 mgのキノコを検出可能であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
キノコによる食中毒事例は、形態学的に判別の難しい食用キノコとの誤食が主な原因である。日本国内で中毒事例のあるキノコは30種類以上存在し、食中毒事例の多いものとしては、ツキヨタケ、クサウラベニタケ、カキシメジ、ニガクリタケ、オオシロカラカサタケ、オオワライタケ、スギヒラタケ、カキシメジ、ドクササコ等が挙げられる。そこで現在、有毒キノコの迅速鑑別法の報告がないもの4種（オオワライタケ、オオシロカラカサタケ、ニガクリタケ、スギヒラタケ）について検討した。さらにカキシメジについては、本実験条件において既報のプライマーではPCR増幅されなかったため、新たにプライマーの配列を設計した。今回設計した食中毒の原因となる有毒キノコ5種（オオシロカラカサタケ、オオワライタケ、ニガクリタケ、スギヒラタケ、カキシメジ）の他に、既報の3種（ドクササコ、ツキヨタケ、シイタケ）の合計8種を標的として、模擬的に調理試験および人工消化試験を行い、これら8種類のプライマーは、迅速鑑別法に利用可能であることがわかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回設計した食中毒の原因となる有毒キノコ5種（オオシロカラカサタケ、オオワライタケ、ニガクリタケ、スギヒラタケ、カキシメジ）の他に、既報の3種（ドクササコ、ツキヨタケ、シイタケ）の合計8種に特異的なプライマーは利用可能であることがわかったが、クサウラベニタケについては、既報のプライマーでは試料によりPCR増幅できるものとできないものとがあった。一般に、クサウラベニタケは、複合種といわれ複数の種を含むと考えられており、分類学的にも整理されていないため本研究においては対象外とした。また、テングタケについても検討を行う。テングタケを始めとするテングタケ属の中には、有毒キノコ（テングタケ、ドクツルタケ、ベニテングタケ等）と食用キノコ（タマゴタケ、ツルタケ等）が含まれ遺伝子配列が類似しているため、特異的プライマーの作成は困難である。しかし、クサウラベニタケやテングタケ類は、国内において食中毒事例の多いキノコとしてあげられるため、今後検討を行う。
これら有毒キノコの種特異的なプライマーを食中毒検体に応用した例は少ない。そこで、迅速鑑別法で検出できる有毒キノコの種類を増やし、保健所および地方衛生研究所において、食中毒検体に適用可能な迅速鑑別法を確立することを目的とし、検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
迅速鑑別法の確立を目的として、特異性向上のためリアルタイムPCR法への適用、および、汎用性向上のため、Loop-mediated isothermal amplification （LAMP）法等への適用について検討する。
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| 次年度使用額の使用計画 |
従来の遺伝子増幅法は増幅反応後、確認のための検出操作が必須であり、これには電気泳動による増幅産物の解析や別途プローブを用いた検出反応が必要など煩雑性を伴っている。LAMP法は原理的に配列を確認しながら増幅を行っているため、特異性が極めて高く、結果を増幅の有無で判定することが可能である。プライマー設計もPCR法と比較して簡単ではないができあがった試薬を使用して検査担当者が行う操作は単純である。サンプルと試薬を60～65℃で30～60分インキュベートすることで増幅物あるいは増幅の有無を簡単、迅速に検出できる方法である。そこで、LAMP法について検討を行い、保健所および地方衛生研究所、だけではなく、医療機関において食中毒検体に適用可能な迅速鑑別法を確立する。
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