ユビキチン化による神経細胞スパインの制御機構

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K21769
• 研究機関: 公益財団法人先端医療振興財団
• 研究代表者: 川辺 浩志 公益財団法人神戸医療産業都市推進機構, その他の部局, 上席研究員
• 研究期間 (年度): 2017 – 2019
• キーワード: スパイン / ユビキチン化 / 超高解像度顕微鏡

研究実績の概要

哺乳類の体内で神経細胞は最も複雑な機能と構造をもっている。神経細胞の発達は、タンパク質や脂質のリン酸化やカルシウムの流入などでトリガーされるシグナル経路ネットワークによって細胞骨格の再構成や細胞膜の供給が制御されることで起こることは報告されている。タンパク質のユビキチン化は基質タンパク質の分解だけでなく、その局在や機能を制御することが知られているが、特に神経細胞における機能は未解明である。本研究では神経発達障害を伴うKaufman症候群原因遺伝子Ube3B、遺伝性癲癇原因遺伝子Nedd4-2やそれらの相同遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを使い、これらのE3 酵素を介した特異的ユビキチン化の神経細胞発達、特にスパインの形成への関与を調べる。次にCRISPR/Cas9法を使い、網羅的にユビキチン関連遺伝子をノックアウトし、スパイン形成に関与する遺伝子ネットワークの全容を明らかにする。
平成29年度は定量的質量分析でUbe3B脳特異的コンディショナルノックアウトマウス(bKO)を使い基質候補タンパク質のスクリーニングを行った。その結果、スパイン形成とスパインの機能調節に重要と考えられる基質候補タンパク質を複数同定した。また、Nedd4-2 bKOとUbe3B bKOを使って行動学的解析を行ったところ、モリス水迷路試験などで異常が観察された。さらに、海馬切片を調製し、電気生理学的に局所フィールド電位を測定したところ、高次脳機能に関連の深いγoscillationに関してNedd4-2 bKOとUbe3BbKOで固有の表現型を確認した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の予定通り、ユビキチン化基質の同定とE3リガーゼ欠損マウスの解析が進んでいる。また、形態的解析を行うためのSTED顕微鏡の設置も完了しており、今後の解析も順調に遂行できると考えている。すでに同定されているNedd4-2の基質候補タンパク質と平成29年度に同定されたUbe3Bの基質候補タンパク質のユビキチン化がスパインの形態制御と脳高次機能制御に重要な役割を果す可能性があると考えている。電気生理学的にγ-oscillationを観察した際に、Nedd4-2 bKOとUbe3B bKOでそれぞれ固有の表現型が観察されており、スパイン形態にもそれぞれ固有の表現型が観察されていることから、それぞれのE3リガーゼが各々の基質をユビキチン化することで、スパインの形態を制御している可能性が高く、今後の発展が期待できると考えている。

今後の研究の推進方策

前年度に引き続き、Ube3B、Nedd4-2やそれらの相同遺伝子のbKOを使い、これらのE3リガーゼによる基質タンパク質のユビキチン化がどのようにスパインの形成に関与するかを検討する。具体的には、まず、これまでに同定された基質候補のリコンビナントタンパク質を使い、in vitroでユビキチン化されることを確認する。次にE3リガーゼbKO神経細胞で基質をノックダウンあるいはノックアウトすることで、スパインの形態と電気生理学的表現型が回復するか検討する。
さらに約600種類あるE3リガーゼと約100種類のDUBをコードする遺伝子について、個々の遺伝子を効率よくノックアウトするためのgRNAあるいは、ノックダウンするためのshRNAを発現するプラスミドを調製する。これらのプラスミドのうち、20～30種類をプールしたものを子宮内電気穿孔法でCas9発現マウスまたは野生型マウスの海馬CA1神経細胞に発現させる。超高解像度顕微鏡でスパインを観察して形態に変化を起こすプールをスクリーニングする。次にプール内の個々のgRNAかshRNAを子宮内電気穿孔法で神経細胞に導入してどの遺伝子の発現を抑えることで、スパイン形態に変化が起きるか検討する。また、超高解像度顕微鏡を使って初期培養神経細胞のライブイメージング実験を行い、スパインの形態形成にこれらの遺伝子がどのように関与しているかも検討する。

次年度使用額が生じた理由

平成30年度にドイツから日本への遺伝子改変マウスと実験試料の輸送とライブイメージング用の顕微鏡用培養装置を購入する必要がある。平成29年度当初購入予定であった子宮内電気穿孔法に使用する遺伝子導入装置が日本の所属先にあるため購入する必要がなくなった。他の機器も現在の所属先と共有して使用することが可能で、予想以上に支出が抑えられたため、この予算を平成30年度に使用する計画である。

研究成果

• [国際共同研究] ベルリン・Charite医科大学/Max Planck Institute of Experimental Medicine/Max Planck Institute for Biophysical Chemistry(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: ベルリン・Charite医科大学/Max Planck Institute of Experimental Medicine/Max Planck Institute for Biophysical Chemistry
• [国際共同研究] ハーバード大学(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: ハーバード大学
• [国際共同研究]
  • 他の国数: 1
• [雑誌論文] Molecular mechanisms of Streptococcus pneumoniae-targeted autophagy viapneumolysin, Golgi-resident Rab41, and Nedd4-1-mediated K63-linked ubiquitination. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, M., Matsuda, R., takada, N., Tomokiyo, M., Yamamoto, S., Shizukusihi, S., Yamaji, T., Yoshikawa, Y., Yoshida, M., Tanida, I., Koike, M., Murai, M., Morita, H., Takeyama, H., Ryo, A., Guan, J. L., Yamamoto, M., Inoue, J. I., Yanagawa, T., Fukuda, M., Kawabe, H., and Ohnishi, M.
  • 雑誌名: Cellular Microbiology
  • DOI: 10.1111/cmi.12846
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] NEDD4 controls spermatogonial stem cell homeostasis and stress response by regulating messenger ribonucleoprotein complexes. (2017)
  • 著者名/発表者名: Zhou, Z., Kawabe, H., Suzuki, A., Shinmyozu, K., and Saga, Y.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 8
  • DOI: 10.1038/ncomms15662
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Deletion of Nedd4-2 results in progressive kidney disease in mice. (2017)
  • 著者名/発表者名: Henshall, T. L., Manning, J. A., Alfassy, O. S., Goel, P., Boase, N. A., Kawabe, H., and Kumar, S.
  • 雑誌名: Cell Death and Differentiation 巻: 24 ページ: 2150-2160
  • DOI: 10.1038/cdd.2017.137
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The E3 ubiquitin ligase NEDD4 enhances killing of membrane-perturbing intracellular bacteria by promoting autophagy. (2017)
  • 著者名/発表者名: Pei, G., Buijze, H., Liu, H., Moura-Alves, P., Goosmann, C., Brinkmann, V., Kawabe, H., Dorhoi, A., and Kaufmann, S.H.E.
  • 雑誌名: Autophagy 巻: 13 ページ: 2041-2055
  • DOI: 10.1080/15548627.2017.1376160
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 神経細胞発達におけるWWP E3ユビキチンリガーゼとmiR140の役割 (2017)
  • 著者名/発表者名: 川辺 浩志
  • 学会等名: 第40回日本神経科学大会