Diels-Alder反応を触媒する酵素が持つ遷移状態制御の解明

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15KT0068
• 研究機関: 静岡県立大学
• 研究代表者: 渡辺 賢二 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (50360938)
• 研究期間 (年度): 2015-07-10 – 2018-03-31
• キーワード: Diels-Alder反応 / 反応機構 / 遷移状態 / 酵素反応 / 生合成

研究実績の概要

取り組んでいる研究課題は化合物の基本骨格において2種類ある。両者とも糸状菌Chaetomium globosumから単離され、Diels-Alder反応の関与により生合成されると推定される。二つに分けて以下に記載した。
(I) Chaetoglobosin Aに関して
C. globosum ΔCgligD/ΔCgpyrGから相同組換えにより、CgbE破壊株を作製し抽出物を解析した。その結果、endo体1およびexo体2の生成が確認されたことから、CgbEがシクロヘキセン環の立体制御に関与することが示唆された。現在、1の生合成に必要と考えられる上記3種の遺伝子（CgbC、DおよびE）をAspergillus nidulansに導入し、異種発現を試みると共にin vitro実験によるCgbEの変換反応の観測を目指して研究を進めている。
(II)Sch210972に関して(II) Sch210972 (3)
化合物3の生合成に必要とされるcghAを含む4種の遺伝子をAspergillus nidulansに導入し、異種発現を試みた。その結果、4つの遺伝子全てを導入した株では化合物3 の発現を確認したが、cghAを除く3種の遺伝子導入株では化合物3およびジアステレオマー4の生産を確認した。このことから、Diels-Alder反応の立体選択性はC. globosumのCghAにより生じるものと推定された。現在、in vitro実験による変換反応の観測を目指しDiels-Alder反応の直接の基質の特定を進めている。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本年度における当初の達成目標を達成し、極めて順調に進捗している。すなわち、炭素骨格の立体選択的な構築から、Diels-Alder反応を触媒する酵素の特定に成功した。また、本研究課題に関する実験結果をまとめ作成し投稿された論文は、Sato, M., Yagishita, F., Mino, T., Uchiyama, N., Patel, A., Chooi, Y.-H., Goda, Y., Xu, W., Noguchi, H., Yamamoto, T., Hotta, K., Houk, K. N., Tang, Y., Watanabe, K. Involvement of lipocalin-like CghA in decalin-forming stereoselective intramolecular [4+2] cycloaddition. ChemBioChem, 16, 2294-2298, 2015. インパクトファクター=3.162（査読有）として採択されている。こういった論文と本年度は注目度の高い国際学会を中心に学会発表を行ってきた。その中には、研究代表者（渡辺賢二）の国際学会での招待講演3件も含まれている。

今後の研究の推進方策

1.Chaetoglobosin生合成遺伝子群に含まれている炭素骨格遺伝子を糸状菌発現系で再構築する。
2.得られた再構築系からDiels-Alder反応の基質あるいは基質が修飾を受けたと考えられる化合物を獲得する。
3.炭素骨格の再構築後、いくつかの生合成遺伝子およびDiels-Alder反応に関与する遺伝子を発現し精製酵素を用いたin vitro合成系により詳細な反応を観察する。

研究成果

• [国際共同研究] University of California, Los Angeles(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: University of California, Los Angeles
• [国際共同研究] The University of Nottingham(マレーシア)
  • 国名: マレーシア
  • 外国機関名: The University of Nottingham
• [雑誌論文] Combinatorial generation of chemical diversity by redox enzymes in chaetoviridin biosynthesis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Sato, M., Winter, J. M., Kishimoto, S., Noguchi, H., Tang, Y., Watanabe, K.
  • 雑誌名: Org. Lett. 巻: 18 ページ: 1446-1449
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.6b00380
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Oxidative trans-to-cis isomerization of olefin in polyketide biosynthesis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto, T., Tsunematsu, Y., Hara, K., Suzuki, T., Kishimoto, S., Kawagishi, H., Noguchi, H., Hashimoto, H., Tang, Y., Hotta, K., Watanabe, K.
  • 雑誌名: Angew. Chem. Int. Ed. 巻: 55 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1002/anie.201600940R1
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Elucidation of Pyranonigrin Biosynthetic Pathway Reveals a Mode of Tetramic Acid, Fused γ-Pyrone, and exo-Methylene Formation. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto, T., Tsunematsu, Y., Noguchi, H., Hotta, K., Watanabe, K.
  • 雑誌名: Org. Lett. 巻: 17 ページ: 4992-4995
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.5b02435
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Development of catalysts from natural product biosynthesis as reagents for enzymatic syntheses of potential drugs as well as natural products (2016)
  • 著者名/発表者名: Kenji Watanabe
  • 学会等名: Biosystems Design Symposium 2.0
  • 発表場所: Singapore
  • 年月日: 2016-03-21 – 2016-03-22
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Aspoquinolone biosynthesis: Non-heme dioxygenase catalyzes atypical oxidations of 6,7-bicycle to form 6,6-quinolone core of viridicatin-type fungal alkaloid (2015)
  • 著者名/発表者名: Kenji Watanabe
  • 学会等名: Pacifichem 2015
  • 発表場所: Honolulu, Hawaii
  • 年月日: 2015-12-15 – 2015-12-20
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Elucidation of pyranonigrin biosynthetic pathway reveals mechanism of fused γ-pyrone, exo-methylene and spiral cyclobutane formation (2015)
  • 著者名/発表者名: Kenji Watanabe
  • 学会等名: Pacifichem 2015
  • 発表場所: Honolulu, Hawaii
  • 年月日: 2015-12-15 – 2015-12-20
  • 国際学会 / 招待講演
• [備考] 研究業績
  • URL: http://www015.upp.so-net.ne.jp/kenji55-lab/