大腸菌細胞質膜をモデルシステムとした生体膜の創成

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15KT0073
• 研究機関: 岩手大学
• 研究代表者: 西山 賢一 岩手大学, 農学部, 教授 (80291334)
• 研究期間 (年度): 2015-07-10 – 2020-03-31
• キーワード: 生体膜 / リポソーム / 自発的膜挿入 / MPIase / 糖脂質酵素

研究実績の概要

本研究では、生体膜と（プロテオ)リポソームとの以下の差異に着目して、生体膜を創成することを目的としている。（１）リポソームでは 膜タンパク質が無秩序かつ自発的に膜挿入する、（２）リポソームは機械的強度、化学物質に対する耐性度が膜小胞より著しく低いという差異がある。
（１）の無秩序な自発的膜挿入に関しては、大腸菌の細胞質膜についてはジアシルグリセロールがリン脂質のわずか１～３％で完全に抑制できることが判明している。これは、大腸菌におけるジアシルグリセロール発現レベルに対応している。一方、コレステロールにも同様の抑制作用があることも判明した。コンピュータ・シミュレーションにより、膜内でのコレステロールとジアシルグリセロールのそれぞれの存在位置を調べたところ、どちらもリン脂質の親水的な頭部近傍の二重層内部の間隙に存在することが判明した。両者は構造的に大きな違いがあるにもかかわらず、膜内での局在位置は極めて類似していた。膜タンパク質の自発的膜挿入は、リン脂質の親水的な頭部近傍の二重層内のスペースが疎水的な物質を吸引してより安定な状態に近づこうとして進行すること、これらの脂質がこのスペースに埋め込まれることにより自発的膜挿入が抑制されることが明らかになった。
（２）に関しては、平成29年度までに高濃度MgやPEG等の化学物質がリポソーム凝集に及ぼす効果を定量的に評価する系を構築した。また、大腸菌内膜由来の抽出物をリポソームに再構成すると、高濃度MgやPEGに対する耐性度が大幅に上昇することが明らかとなり、生体膜に機械的強度、化学物質に対する耐性度を付与する因子の可溶化・再構成のシステム構築も完了した。続いてこの因子の精製を進めたところ、目的因子は、分子量が1kDa～3kDaで、負電荷をもつ両親媒性の化合物であることが判明した。因子の生成はほぼ完了したため、今後は因子の構造を明らかにする。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

コレステロールによる自発的膜挿入の抑制については、ジアシルグリセロールによる抑制と同様の機構で進むことを論文として報告し、さらにコンピューター・シミュレーションにより自発的膜挿入抑制の分子機構を明らかにし、論文報告することができた。膜に強度を与える因子の生成については、機能評価システムの構築、因子の抽出条件と再構成条件も決定が終了し、構造解析に進む段階に達した。最終年度に向けて予定通り構造解析が実施できる状況であるため「（２）おおむね順調に進展している」と評価した。

今後の研究の推進方策

（１）自発的タンパク質膜挿入の抑制については、予定していた研究が終了したため、今後は（２）の機械的強度、化学物質に対する耐性度を付与する因子の構造解析に集中する。十分な高純度精製標品を調製し、構造決定を進める。

次年度使用額が生じた理由

（１））の無秩序な自発的膜挿入の抑制機構の解析について、予定より早く終了したため、物品費分に余剰が生じた。最終年度に、（２）の機械的強度、化学物質に対する耐性度を付与する因子の構造解析を加速させるために使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Expression of alcohol oxidase gene from Ochrobactrum sp. AIU 033 in recombinant Escherichia coli through the twin-arginine translocation pathway (2019)
  • 著者名/発表者名: Matsumura Kenji、Yamada Miwa、Yamashita Takeshi、Muto Hitomi、Nishiyama Ken-ichi、Shimoi Hitoshi、Isobe Kimiyasu
  • 雑誌名: Journal of Bioscience and Bioengineering 巻: 128 ページ: 13～21
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2018.12.012
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Increased expression of the bacterial glycolipid MPIase is required for efficient protein translocation across membranes in cold conditions (2019)
  • 著者名/発表者名: Sawasato Katsuhiro、Suzuki Sonomi、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 294 ページ: 8403～8411
  • DOI: 10.1074/jbc.RA119.008457
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] YnbB is a CdsA paralogue dedicated to biosynthesis of glycolipid MPIase involved in membrane protein integration (2019)
  • 著者名/発表者名: Sato Ryo、Sawasato Katsuhiro、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 510 ページ: 636～642
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.01.145
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] CdsA is involved in biosynthesis of glycolipid MPIase essential for membrane protein integration in vivo (2019)
  • 著者名/発表者名: Sawasato Katsuhiro、Sato Ryo、Nishikawa Hanako、Iimura Naoki、Kamemoto Yuki、Fujikawa Kohki、Yamaguchi Toshiyuki、Kuruma Yutetsu、Tamura Yasushi、Endo Toshiya、Ueda Takuya、Shimamoto Keiko、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: No 1372
  • DOI: 10.1038/s41598-018-37809-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Free energy profiles of lipid translocation across pure POPC and POPC/CHOL bilayer : all - atom molecular dynamics study (2019)
  • 著者名/発表者名: Saito Hiroaki、Morishita Tetsuya、Mizukami Taku、Nishiyama Ken-ichi、Kawaguchi Kazutomo、Nagao
  • 雑誌名: Journal of Physics: Conference Series 巻: - ページ: in press
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Enzyme-like glycolipids MPIase involved in membrane protein integration of E. coli (2019)
  • 著者名/発表者名: Kohki Fujikawa, Ken-ichi Nishiyama and Keiko Shimamoto
  • 雑誌名: Trends in Glycoscience and Glycotechnology 巻: - ページ: in press
  • DOI: 10.4052/tigg.1705.1E
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 大腸菌膜タンパク質の膜挿入に関与する酵素様糖脂質MPIase (2019)
  • 著者名/発表者名: 藤川 紘樹、西山 賢一、島本 啓子-
  • 雑誌名: Trends in Glycoscience and Glycotechnology 巻: - ページ: in press
  • DOI: 10.4052/tigg.1705.1J
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cholesterol blocks spontaneous insertion of membrane proteins into liposomes of phosphatidylcholine (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakamura Shota、Suzuki Sonomi、Saito Hiroaki、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: The Journal of Biochemistry 巻: 163 ページ: 313～319
  • DOI: 10.1093/jb/mvx083
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Molecular dynamics study of binary POPC bilayers: molecular condensing effects on membrane structure and dynamics (2018)
  • 著者名/発表者名: Saito Hiroaki、Morishita Tetsuya、Mizukami Taku、Nishiyama Ken-ichi、Kawaguchi Kazutomo、Nagao Hidemi
  • 雑誌名: Journal of Physics: Conference Series 巻: 1136 ページ: 012022～012022
  • DOI: 10.1088/1742-6596/1136/1/012022
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Syntheses and Activities of the Functional Structures of a Glycolipid Essential for Membrane Protein Integration (2018)
  • 著者名/発表者名: Fujikawa Kohki、Suzuki Sonomi、Nagase Ryohei、Ikeda Shiori、Mori Shoko、Nomura Kaoru、Nishiyama Ken-ichi、Shimamoto Keiko
  • 雑誌名: ACS Chemical Biology 巻: 13 ページ: 2719～2727
  • DOI: 10.1021/acschembio.8b00654
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] タンパク質膜挿入・膜透過に関与する糖脂質MPIaseの構造と機能 (2019)
  • 著者名/発表者名: 西山賢一
  • 学会等名: 理学部講演会（山形大学、山形市）
  • 招待講演
• [学会発表] タンパク質膜挿入・膜透過に関与する糖脂質MPIase の構造と機能 (2019)
  • 著者名/発表者名: 西山賢一
  • 学会等名: 第１回細胞形成研究会（岩手大学、盛岡市）
  • 招待講演
• [学会発表] タンパク質膜挿入に必須の糖脂質MPIaseの生合成機構の解明とin vivoにおける機能解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 沢里克宏、西山賢一
  • 学会等名: 第１回細胞形成研究会（岩手大学、盛岡市）
• [学会発表] 大腸菌のタンパク質輸送システムの改変を目指したMPIaseの構造と機能の解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 鈴木苑実、藤川絋樹、島本啓子、池田汐里、西山賢一
  • 学会等名: 第４回デザイン生命工学研究会（早稲田大学TWINS、新宿区）
• [学会発表] タンパク質膜挿入に関与する糖脂質酵素MPIaseの生合成中間体の生成機構 (2019)
  • 著者名/発表者名: 亀本有生、川上真由、藤川紘樹、島本啓子、西山賢一
  • 学会等名: 日本農芸化学会2019年度大会（東京農業大学、世田谷区）
• [学会発表] 大腸菌の膜タンパク質膜挿入機構解明を目指した蛍光標識MPIase類縁体の合成 (2019)
  • 著者名/発表者名: 藤川紘樹、梅川雄一、西山賢一、島本啓子
  • 学会等名: 日本農芸化学会2019年度大会（東京農業大学、世田谷区）
• [学会発表] Bacterial CdsA and eukaryotic Cds1p are involved in biosynthesis of MPIase, a glycolipozyme essential for membrane protein integration (2018)
  • 著者名/発表者名: Yuki Kamemoto, Ryo Sato, Katsuhiro Sawasato, Naoki Iimura, Ken-ichi Nishiyama
  • 学会等名: International Symposium on Innovative Agriculture and Fishery (ISIAF2018) (Iwate University, Morioka)
  • 国際学会
• [学会発表] タンパク質膜挿入に関与する糖脂質酵素MPIase生合成におけるCdsAの機能の解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 亀本有生、佐藤諒、沢里克宏、川上真由、西山賢一
  • 学会等名: 日本生化学会東北支部第84回例会（岩手医科大学薬学部、岩手県矢巾町）
• [学会発表] タンパク質膜挿入反応に必須の糖脂質酵素MPIaseの部分化学合成標品を用いた構造と機能の研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 鈴木苑実、藤川絋樹、島本啓子、池田汐里、西山 賢一
  • 学会等名: 日本生化学会東北支部第84回例会（岩手医科大学薬学部、岩手県矢巾町）
• [学会発表] 糖脂質酵素 MPIase生合成における CdsAの機能 (2018)
  • 著者名/発表者名: 亀本有生、佐藤諒、沢里克宏、川上真由、西山賢一
  • 学会等名: 第 15 回 21 世紀大腸菌研究会（山形座瀧波、山形県南陽市）
• [学会発表] タンパク質膜挿入に必須の糖脂質酵素MPIaseの部分化学合成標品を用いた構造と機能の研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 鈴木苑実、藤川絋樹、島本啓子、池田汐里、西山 賢一
  • 学会等名: 第 15 回 21 世紀大腸菌研究会（山形座瀧波、山形県南陽市）
• [学会発表] 糖脂質MPIaseはTAT（Twin-Arginine Translocation）膜透過反応に必須である (2018)
  • 著者名/発表者名: 西川華子、菅野琴華、沢里克宏、山田美和、菊池慶実、西山賢一
  • 学会等名: 第 15 回 21 世紀大腸菌研究会（山形座瀧波、山形県南陽市）
• [学会発表] タンパク質膜挿入に必須の糖脂質MPIaseの生合成におけるCDPジアシルグリセロール合成酵素の機能の解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 亀本有生、佐藤諒、沢里克宏、川上真由、西山賢一
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会（国立京都国際会館、京都市）
• [学会発表] タンパク質膜挿入反応に関わる糖脂質酵素MPIaseの構造と機能の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 鈴木苑実、藤川絋樹、池田汐里、島本啓子、西山賢一
  • 学会等名: 第91回日本生化学会大会（国立京都国際会館、京都市）
• [学会発表] Increase in the expression level of Glycolipozyme MPIase is required for the efficient protein translocation in the cold (2018)
  • 著者名/発表者名: Katsuhiro Sawasato, Sonomi Suzuki, Ken-ichi Nishiyama
  • 学会等名: Bacterial Protein Export 2018 (The Leuven Ibstitute for Ireland, Leuven, Belgium)
  • 国際学会
• [学会発表] MPIase, a glycolipid essential for protein integration, is involved in the TAT pathway (2018)
  • 著者名/発表者名: Hanako Nishikawa, Kotoka Kanno, Katsuhiro Sawasato, Miwa Yamada, Ken-ichi Nishiyama
  • 学会等名: Bacterial Protein Export 2018 (The Leuven Ibstitute for Ireland, Leuven, Belgium)
  • 国際学会
• [学会発表] YidC accelerates glycolipozyme MPIase-dependent integration of membrane proteins (2018)
  • 著者名/発表者名: Masaru Sasaki, Hanako Nishikawa, Sonomi Suzuki, Michael Moser, Katsuhiro Sawasato, Hideaki Matsubayashi, Kaoru Kumazaki, Tomoya Tsukazaki, Yutetsu Kuruma, Maria Huber, Osamu Nureki, Takuya Ueda, Ken-ichi Nishiyama
  • 学会等名: Bacterial Protein Export 2018 (The Leuven Ibstitute for Ireland, Leuven, Belgium)
  • 国際学会
• [学会発表] Glycolipozyme MPIase is essential for membrane protein integration and facilitates protein translocation in Escherichia coli (2018)
  • 著者名/発表者名: Katsuhiro Sawasato, Ryo Sato, Hanako Nishikawa, Naoki Iimura, Yuki Kamemoto, Kohki Fujikawa, Toshiyuki Yamaguchi, Yutetsu Kuruma, Yasushi Tamura, Toshiya Endo, Takuya Ueda, Keiko Shimamoto, Ken-ichi Nishiyama
  • 学会等名: Bacterial Protein Export 2018 (The Leuven Ibstitute for Ireland, Leuven, Belgium)
  • 国際学会
• [学会発表] Structure and function of MPIase involved in membrane protein integration and preprotein translocation (2018)
  • 著者名/発表者名: Ken-ichi Nishiyama
  • 学会等名: BMB Seminar (Freiburg University, Germany)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] タンパク質膜挿入を触媒する糖脂質酵素MPIaseの中間体の生合成機構の解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 亀本有生、佐藤諒、川上真由、藤川紘樹、島本啓子、西山賢一
  • 学会等名: 第13回無細胞生命科学研究会（愛媛大学、松山市）
• [備考] 岩手大学農学部応用生物化学科分子生物学研究室
  • URL: http://news7a1.atm.iwate-u.ac.jp/~sec/