| 研究課題/領域番号 |
15KT0079
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
渡邉 正勝 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (90323807)
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| 研究期間 (年度) |
2015-07-10 – 2018-03-31
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| キーワード | 細胞間相互作用 / 反応拡散 / 色素細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、細胞自律的なパターン形成原理として反応拡散モデルに注目し、そのモデルケースとしてゼブラフィッシュの体表模様（ストライプ模様）形成メカニズムの解明を目指している。これまでの研究により、ゼブラフィッシュの体表にパターンを作る２種類の色素細胞、黒色素胞と黄色素胞の間には短距離の反発作用と長距離の活性化作用が存在することが分かっている。そして、長距離の相互作用には>100umの長い細胞仮足が重要な機能を担っているのではないかと考えられている。反応拡散モデルでは、安定した拡散の形成・維持が問題になっていたが、細胞仮足のファクターを加えることでこの問題を解決できる。このため、細胞仮足の機能及びその形成メカニズムを解明する意義は大きい。これまでの研究により、この細胞仮足上のシグナルとしてNotch-DeltaとGap Junctionの重要性があげられている。本研究では①細胞仮足とこれら因子の役割、及び②ここに関わる新規因子のスクリーニングを目指している。
平成２７年度はNGSを用いたトランスクリプトーム解析を行い、各色素細胞で発現する遺伝子リストの作成を行った。更に、細胞間相互作用にかかわることが予想される遺伝子について強制発現系及びCRISPRを用いた遺伝子破壊系統の作製を順次行い、パターン形成への関与を検討することにした。平成２８年度は、引き続き強制発現系統と遺伝子破壊系統の作製を進めた。また、細胞仮足の形成に関してはin vitro培養系で黄色素胞－黒色素胞間に長い細胞仮足を形成する条件を整え、変異体間での比較解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
細胞間相互作用に関与する新規因子のスクリーニング目的で遺伝子破壊系統の作製を進めている。遺伝子の機能から、膜蛋白あるいは分泌タンパクに注目した。遺伝子破壊の致死性を考慮に入れて、一時スクリーニングとして、F0世代で体表模様変化を起こした遺伝子の選択を行った。その後の、得られた遺伝子についてノックアウト系統の作製や遺伝子機能に応じた解析を進めた。これまでに、約４０の遺伝子について破壊系統の作製を行ったところ、６種類の遺伝子の破壊系統F0代で体表模様に変化がみられた。その後、交配によりノックアウトラインの作製を行ったが、表現型として体表模様変化が得られた個体はなく、ドミナントネガティブ変異体の作製の必要性が上がっている。ノックアウトラインを作製した遺伝子の中にはNotch-Deltaシグナルに関する遺伝子も含まれており、多重変異体の作製の必要性、更には必要に応じてコンディショナルノックアウトのラインの作製が必要であると考えられる。
細胞仮足の詳細な解析を目指してin vitro培養系での初代培養及び細胞間相互作用の解析を進めた。特に細胞間距離を変化させた培養を行い、黄色素胞―黒色素胞間の仮足による接触刺激及びこの時の細胞の振る舞いについて、動画撮影を行うとともに、細胞骨格の観察を、野生型由来色素細胞に加えて体表模様変異体由来の色素細胞についても行っている。今後、相互作用の定量化を進める計画である。
ところで、これまでは分化後の色素細胞間相互作用に注目してきたが、未分化細胞と分化後細胞との間の相互作用の解析も必要になってきた。未分化細胞の検出系の作製と解析が今後の課題の一つである。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き遺伝子高発現系統と遺伝子破壊系統の作製を進めていき、細胞間相互作用に関連する遺伝子のスクリーニングを行う。F0世代で体表模様変化がみられた遺伝子についてはノックアウト系統の作製、遺伝子高発現系統の作製を進め、それぞれ機能解析に進む。
これと並行してin vitro培養系における細胞仮足の詳細な解析を行う。アガロース加工ディッシュ上で色素細胞を培養し、細胞間距離に応じた細胞仮足を人工的に作り出し、その動態の解析を行う。これらの解析を、黄色素胞―黒色素胞―黒色素胞といった様々な組み合わせで行うことにより、細胞間の相互作用の解析を行う。また、体表模様変異体由来の色素細胞間での比較を行うことにより、関連遺伝子の影響も検討していく。
ところで、本研究では分化後の色素細胞間の相互作用に注目した計画を進めてきたが、他の研究グループから、色素細胞の前駆細胞が伸ばす細胞仮足の重要性が指摘され始めてきた。本研究計画も、上記計画に加えて前駆細胞の解析も行う必要が出てきている。この解析のために、sox10プロモーターやpax7プロモーターを用いた前駆細胞解析用のラインを作製し、細胞動態の解析を進めていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
分化後の細胞仮足の観察に焦点を絞って研究を進めてきたが、未分化細胞の細胞仮足についても解析を行う必要ができてた。このため、部分的に計画の立て直しが必要になり、消耗品代及びゼブラフィッシュの飼育補助のための人件費分を翌年に残す必要が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
ゼブラフィッシュ飼育補助員の雇用費用として50万円、in vitro実験系に用いているアガロース加工用レーザーの交換費用として100万円を予定している。
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