| 研究課題/領域番号 |
15KT0079
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
渡邉 正勝 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (90323807)
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| 研究期間 (年度) |
2015-07-10 – 2019-03-31
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| キーワード | 細胞間相互作用 / 反応拡散 / 色素細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、反応拡散原理を念頭に置いた細胞自律的なパターン形成の分子メカニズムの解明を目指している。研究対象としてはゼブラフィッシュの体表にみられるストライプパターンとこれを構成する二種類の色素細胞、黒色素胞と黄色素胞をターゲットにしている。反応拡散原理で示される2因子間の反発と活性化という相反する作用が、細胞の配置（距離）とその細胞の持つ細胞仮足の長さで決められているという仮定のもと、ここにかかわる因子の単離とそのメカニズムの解明を進めている。H27年度、H28年度に、尾鰭から単離した色素細胞のNGS解析を行い、色素細胞で発現がありかつ細胞間相互作用にかかわる膜蛋白質及び分泌蛋白質に焦点を絞った。CRISPRを用いたノックアウト系統の作製及び色素細胞特異的遺伝子のプロモーターを用いた過剰発現系の作製を行い、その評価を行った。ノックアウトのF0世代ではパターンに異常が見られた遺伝子が複数得られたが、次世代、次々世代での形質が得られておらず、現在のところ確定的な候補遺伝子は得られていない。また、の過程で、色素細胞前駆細胞の持つ細胞仮足が細胞間の反発作用にかかわるという報告があった。このためH29年度は色素細胞前駆細胞を蛍光標識したゼブラフィッシュ遺伝子組換え系統を作製し、色素細胞前駆細胞をセルソーターを用いて単離した後、NGSを用いた遺伝子発現解析を行った。現在ここに発現する膜蛋白質・分泌タンパク質の解析を進めている。また、in vitroにおける細胞仮足の動態解析も引き続き行っている。色素細胞の初代培養細胞にトランスフェクションを行い、対象となる遺伝子の機能解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
細胞仮足の形成に関して、野生型の他、チューブリンタンパク質の一つに異常が生じているゼブラフィッシュ変異体の色素細胞に関して、形態観察、in vitroでの動態観察を行った。この変異体では体表上の黒色素胞領域と黄色素胞領域が混在しており、領域分けにこのチューブリンが関与する細胞仮足が重要な機能を担っている可能性が示唆された。
一方、ここにかかわる分子の単離を目指して、黒色素細胞、黄色素細胞、色素細胞前駆細胞それぞれに対してNGSを用いて遺伝子発現の解析を行い、細胞間相互作用に関与する遺伝子候補を抽出した。この中には、色素細胞間の短距離での反発作用と、長距離での活性化作用のそれぞれに関与する候補遺伝子が含まれている。これまでに約40遺伝子についてCRISPRを用いた遺伝子ノックアウトを行った。F0世代で体表模様に異常の見られた遺伝子に関して、F1世代、F2世代の取得のため交配を繰り返している。このスクリーニングにより取得できた遺伝子は、現在のところ体表模様形成に関わる既知遺伝子が主で、新規遺伝子の取得には至っておらず、引き続きスクリーニングを行う計画である。
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| 今後の研究の推進方策 |
最近取得した色素細胞前駆細胞のNGSを用いた遺伝子発現のデータをもとに、遺伝子破壊株の作製・解析を進める。このデータをもとに、細胞間相互作用における細胞仮足の機能解明を目指す。
NGS解析のデータに関しては、論文の作製中であり、早々の完成を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
NGSによる遺伝子発現解析とCRISPRによる遺伝子破壊実験により、細胞間相互作用因子の単離を行っているが、現状で新規因子の単離に至っておらず、今後もこの実験を継続して因子の単離を目指す。このため、ゼブラフィッシュの遺伝子破壊実験及びゼブラフィッシュの管理維持のための実験補助員の雇用が必要であり、本予算を雇用費及び実験のための物品費に充てる。
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