| 研究課題/領域番号 |
15KT0086
|
|---|
| 研究機関 | 徳島大学 |
|---|
研究代表者 |
米村 重信 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (60192811)
|
|---|
| 研究分担者 |
柴田 達夫 国立研究開発法人理化学研究所, 生命システム研究センター, チームリーダー (10359888)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2015-07-10 – 2018-03-31
|
| キーワード | 上皮 / 極性 |
|---|
| 研究実績の概要 |
極性関連因子の濃度分布の計測に関しては、蛍光抗体法による観察用試料を作成するまでは問題なくできている。浮遊培養中の細胞を扱っているため、サンプルが様々な方向を向いてしまい、細胞をアピカル／バソラレテル軸に平行に切った場合の断面の蛍光強度の分布を示すことにみ問題がある。たまたまその方向を向いた細胞をイメージングしようとすると、確率が低いことになり、三次元輝度情報を取得したのちに画像を回転させることで希望通りの断面の画像を得ようとするとなかなか対応できる画像処理ソフトがない状況である。これについてはさらに改善をしていく。
一方で、極性関連因子の絶対的な濃度がアピカルとバソラテラルとの境界形成に重要なのであれば、細胞のサイズが大きくなれば、例えばアピカルの極が二つ以上形成されるということも考えられる。その考えに沿って、使用しているR2/7細胞のうち、自然に体積の大きくなったものに注目して、極性の状態を観察してみた。その結果、大きなサイズの細胞では、しばしば、アピカルとしてリングに取り囲まれる領域が二つ以上あることが観察された。これに関してはさらに検証作業が必要であるが、境界形成の基本的な仕組みを反映している可能性がある。
また、網羅的RNAi実験の準備として、384ウェルフォーマットでのRNAiを効率高く行うための条件検討（siRNAを塗布したプレートに細胞を播種する方法が最良、アピカルを認識するために適した方法（ZO-1の蛍光染色がベスト）、固定法(ホルムアルデヒドと比較するとTCAの方が良い）をほぼ終了することができた。今後はハイスループットのスクリーニングのために、ZO-1で囲まれたアピカル領域の面積を自動的に測定するようなことをうまく解析ソフトに実行させられるかの検討に移る。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
一番大きいことは、申請時に所属が理研であったところ、本務が徳島大学となり、研究室の引っ越しが行われる年に当たったので、じっくりと研究を行うことが、時間的にも人的にも難しかったということである。しかしながら、昨年度中には引越しは完了し、移設した機器や徳島大での共通機器などを使用し、また新たに研究に参画できる学生なども来たことから、今年度は大きく進展すると考えられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
極性関連因子の濃度分布に関しては定量的なデータを取得して、数理的な解析のための基礎データとし、数理的な解析を進める。網羅的RNAiに関しては、かなり準備が整った。具体的にはsiRNAライブラリーを持ち、解析の実績のある東大薬学部との共同研究により本年度前半から始める。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度に関して、本務が理研から徳島大学に移り、研究室の引っ越しを行う年度であったことから、落ち着いて継続的に実験できる環境が限られていたため、引っ越し完了後の徳島大学で集中して必要な物品などを使用することにした。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
本格的な網羅的RNAiを開始することにより相当額のプレート、トランスフェクション試薬を購入することになる。また、興味深い遺伝子が見つかってきた場合、それらの機能解析のためには分子生物学から生化学、細胞生物学に至るまでの幅広いアプローチが必要となり、様々な物品、試薬を購入することになる。
|
