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GemininはDNA複製のライセンシング因子であるCdt1と結合し、Cdt1の前複製複合体(preRC)との結合を阻害する分子である。Gemininが分解することによってCdt1は遊離しpreRCと結合することによて複製が開始すると考えられている。
すでにわれわれはGemininノックアウトマウスを作製し胎生7.5日には死亡することを確認していた。そこで本年度は、3.5日胚を回収し、その形態学的特徴を調べると同時に培養によって分化誘導を行った。その際、遺伝子型を決定するためのスクリーニング法の開発を行った。
まず、3.5日胚を母体子宮より回収し3時間培養した。その際、Nocodazol処理によって細胞周期のM期に同調させると同時に、培養液中にBrdUを添加しS期の細胞をラベルした。その後、パラホルムアルデヒドで固定し、抗リン酸化ヒストンH3抗体及び抗BrdU抗体にて免疫染色を行った。蛍光ラベルした2次抗体を用いて発色した3.5日胚を封入剤中に滴下し倒立蛍光顕微鏡で観察した。その後、封入剤をPBSで洗い、胚全体をプロテネースKで処理し、PCR反応を行い胚の遺伝子型の決定を行った。この結果、Gemininノックアウトマウスは、3.5日胚で、S期細胞が野生型に比較し少なく、逆にDNA含量が増加したことを伺わせる巨大な核をともなった大きな核が観察された。この結果は、カエル胚などで観察されていたGemininの機能がほ乳類胚でも機能していることを示唆している。
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