| 研究課題/領域番号 |
16041245
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| 研究機関 | 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(共通施設) |
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研究代表者 |
永山 国昭 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(共通施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンター, 教授 (70011731)
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| 研究分担者 |
岡村 康可 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(共通施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンター, 教授 (80201987)
山崎 俊夫 理化学研究所, ゲノム科学総合研究センター, チームリーダー (60273710)
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| キーワード | 電子顕微鏡 / 構造生物学 / 超分子多型 / 1分子計測 / 溶液熱力学 |
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| 研究概要 |
多量体蛋白質や蛋白質会合体の超分子多型(サブユニット構造ゆらぎ)について電子顕微鏡による1分子解析法を開発するためシャペロニンGroELを用いて研究を行った。GroELは7量体の環状構造2つが結合することで直径約14nm、高さ約15nmという比較的大きな立体構造を形成する蛋白質であり、蛋白質の多型のモデルとして都合がよい。ラベル剤としてはMonomaleimido Nanogoldを選んだが、これは共有結合により蛋白質のCysに特異的に結合する金クラスター(直径1.4nm)であり、高いコントラストが得られることから電子顕微鏡により観察しやすい利点がある。
天然構造状態のGroELは表面に3つのCysを持つ。金クラスターでのラベル化を試みたが、実際にはCysが金クラスターと結合するのに十分なほど蛋白質表面に位置しないことからラベル化されなかった。そこで全てのCysをAlaに置換し、242番のAlaをCysに置換したミュータントGroELを利用することで部位特異的なラベル化を試みた。ラベル化されたGroELをGold Enhanceによるブロッティングと電子顕微鏡観察により解析した。さらにラベル化されたGroELをゲルろ過クロマトグラフィにより未反応の金クラスターから分離精製したところ、GroELの上部に黒いドットとして金クラスターが存在することを電子顕微鏡により観察することができた。
現在この方法を用いてADPやATPによるGroELの形態変化と、同一視野を傾斜することにより得られる金クラスター間の距離情報の変化を調べているところである。
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