| 研究概要 |
【研究目的】培養細胞と個体レベルでの知見のギャップを埋めるためIntravital Cell Imaging法を開発し、個体レベルでニューロンおよびグリアのカルシウムシグナルをイメージ化するシステムを構築、正常時と虚血時のグリア・ニューロンにおけるグルタミン酸を介したシグナル伝達を検討する。
【研究実施計画】脳の標識方法(脳へのin situ lipofection法による蛍光蛋白発現法と蛍光色素投与法)の開発および観察方法(共焦点蛍光顕微鏡とファイバー共焦点顕微鏡による蛍光観察法)の開発を今年度の目標とした。
【方法および結果】全麻下のラットで、正立顕微鏡(BX50WI, Olympus)、共焦点Unit (CSU21,Yokogawa)、Image IntensifierおよびCCD Cameraにより画像を取得し解析した。ラットに慢性脳室カニュラを設置し、Plasmid DNA[Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)をベースにしたカルシウムセンター蛍光蛋白であるCameleon:50μg/kg]をLiposomeと共に1日2回2日間投与後2日目に観察、または1回投与後48時間後に観察すると、両側の大脳皮質・基底核・海馬に観察可能な発現が見られた。またcranial windowを設け、硬膜外からCalcium Orange (1mMx1h)を投与し硬膜外にカバーガラスを固定し共焦点顕微鏡で観察できた。10分間の前脳虚血を顕微鏡観察下に負荷し、脳表カルシウムイオン濃度の持続的上昇が観察できた。引き続きファイバー共焦点顕微鏡(横河電機と共に新規開発)による観察、超音波照射による遺伝子導入促進について検討中である。
【まとめ】硬膜外からの蛍光色素投与、脳室内へのPlasmid DNA投与により、生きているラットで脳表からの共焦点蛍光像の観察が可能になった。
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