Intravital Cell Imagingによる脳内カルシウム信号の検討

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16047212
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 山本 清二 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助教授 (60144094)
• 研究分担者: 寺川 進 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 教授 (50014246) ; 櫻井 孝司 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助手 (50283362)
• キーワード: 蛍光蛋白 / 蛍光色素 / カルシウムイメージング / カメレオン / 共焦点レーザー顕微鏡 / ファイバー共焦点顕微鏡 / 生体内細胞イメージング / GFAP

研究概要

【研究目的】
培養細胞と個体レベルでの知見のギャップを埋めるためIntravital Cell Imaging法を開発し、個体レベルでニューロンおよびグリアのカルシウムシグナルをイメージ化するシステムを構築、虚血時のグリア・ニューロンにおけるグルタミン酸を介したシグナル伝達を検討することを目的とした。
【方法および結果】
SDラット(体重300g)にてイメージングに適する4血管閉塞モデルを作成。カルシウムイオン指示性蛍光色素であるfluo-3/AM(440μM、2.5μl)を海馬CA1および大脳皮質にmicroinjectionし、ファイバー共焦点顕微鏡(imaging fiberを共焦点スキャナ[CSU21,Yokogawa]とカップルさせたもの)で虚血前後の蛍光像を観察した。一過性(10min)前脳虚血負荷により、脳血流は海馬および大脳皮質共に約30%まで低下。海馬CA1領域では前脳虚血により虚血中からおよび血流再開後20分まで持続的に細胞内Ca^<2+>濃度が上昇していたが、大脳皮質では細胞内Ca^<2+>濃度の上昇は虚血中のみであった。この海馬の特殊性は虚血に対する脆弱性の原因の一つである可能性があり今後の検討を要する。また、electroporation法(10mA、30-40V、2ms-on 98ms-off x 10)によりadult ratにおいて、脳内の任意の部位にin situでCameleon(カルシウムイオン指示性の蛍光蛋白)を発現させることが可能になった。またGFAP陽性細胞に選択的にCameleonが発現するようベクターの組み替えを行った。これらにより、グリア特異的には発現したCameleonによりカルシウムイオン濃度の変化を観察できるようになった。今後、虚血時におけるグリア細胞のカルシウム反応を検討し、上記の海馬の特殊性の原因をグリア細胞に求め検索する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Selective accumulation and strong photodynamic effects of a new photosensitizer, ATX-S10・Na(II), in experimental malignant glioma (2005)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto J, Hirano T, Li S, Koide M, Kohno E, Inenaga C, Tokuyama T, Yokota N, Yamamoto S, Terakawa S, Namba H.
  • 雑誌名: Int J Oncol 27 ページ: 1207-1213
• [雑誌論文] Alteration of intracellular histamine H_2 receptor cycling precedes antagonist-induced up-regulation (2005)
  • 著者名/発表者名: Osawa S, Kajimura M, Yamamoto S, Ikuma M, Mochizuki C, Iwasaki H, Hishida A, Terakawa S.
  • 雑誌名: Am J Physiol, Gastrointest Liver Physiol 289 ページ: G880-G889
• [雑誌論文] The activation of exocytotic sites by the formation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate microdimains at syntaxin clusters (2005)
  • 著者名/発表者名: Aoyagi, K., Sugaya, T., Umeda, M., Yamamoto, S., Terakawa, S., Takahashi, M
  • 雑誌名: J Biol Chem 280 ページ: 17346-17352
• [雑誌論文] Free radical production in rat ischemic brain measured by intravital fluorescence imaging (2005)
  • 著者名/発表者名: Wang Y, Yamamoto S, Miyakawa A, Sakurai T, Terakawa S
  • 雑誌名: Neurotrauma Res 17(In press)
• [雑誌論文] Morphological changes of hippocampal neurons in AMPA (alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)-mediated excitotoxicit (2005)
  • 著者名/発表者名: Ibaraki K, Yamamoto S, Wang T, Terakawa S
  • 雑誌名: Neurotrauma Res 17(In press)
• [雑誌論文] Acute DNA fragmentation detected by comet assay in excitotoxicity (2004)
  • 著者名/発表者名: Ibaraki K, Yamamoto S, Fan W, Terakawa S
  • 雑誌名: Neurotrauma Res 16 ページ: 36-38