レーザーを駆使した単一細胞内反応場の構築と計測

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16072211
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 増原 宏 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (60029551)
• 研究分担者: 朝日 剛 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (20243165) ; 今元 泰 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 助教授 (80263200) ; 開 祐司 京都大学, 再生医科学研究所, 教授 (40144498)
• キーワード: 単一細胞 / 蛍光イメージング / フェムト秒レーザー / アクチィンフィラメント / 緑色蛍光蛋白質 / 衝撃波 / 形態変化

研究概要

本研究では顕微鏡技術とレーザー技術を用いて単一生細胞でおこる反応の新しい計測法の開発と、それを駆使した反応ダイナミクスの実時間・実空間解析を進めている。本年度は、数100nmの空間分解能を持ち、非発光物質でも計測可能な光散乱分光スペクトル測定・イメージングシステムなどの動的計測法の構築ならびにレーザー照射による細胞形態変化ダイナミクスの解析を行った。以下に主な成果を示す。
1.単一細胞内反応計測のための顕微光散乱分光システムの開発
フェムト秒白色光をプローブ光とした共焦点光散乱顕微分光・イメージングシステムを開発した。高分子フィルム中に分散させた単一金ナノ粒子(直径100nm)の測定からサブμmの空間分解能(平面方向が約300nm、光軸方向が約800nm)で広帯域(400〜800nm)レイリー散乱分光イメージングが可能であることを示した。本手法を用い、マウスNIH3T3細胞内部に取り込まれた金ナノ粒子(100nm)の三次元イメージと各ナノ粒子の光散乱スペクトルの同時取得に成功した。
2.フェムト秒レーザー刺激による細胞形態変化と蛍光分光イメージング
緑色蛍光タンパク質(EGFP)修飾アクチンを発現させたマウスNIH3T3細胞を試料とし、細胞内のアクチンストレスファイバー、細胞皮膚、糸状仮足をフェムト秒レーザー照射し、その後の破壊と再生過程を顕微蛍光イメージングにより観察した。アクチンストレスファイバーの場合には切断後10秒以内に1〜4μm収縮し、その後数10分から数時間かけて再生する様子を観察することに成功した。
3.赤色光照射に伴う高度好塩菌の単一細菌内pH変化の測定(班内共同研究)
高度好塩菌(Halobacterium salinarum S-9)内のpHが赤色光照射に伴い変化する過程を、単一細菌について調べた。顕微鏡下でpH感応性色素を導入した1個の細菌をレーザートラッピングしながら顕微蛍光測定を行った。

研究成果

• [雑誌論文] Cloning and characterization of nif structural and regulatory genes in the purple sulfur bacterium, Halorhodospira halophila (2006)
  • 著者名/発表者名: Tsuihiji, H., Yamazaki, Y., Kamikubo, H., Imamoto, Y., Kataoka, M
  • 雑誌名: J.Biosci.Bioeng. (in press)
• [雑誌論文] The crystal structure of the R52Q mutant demonstrates a role for R52 in chromophore pKa regulation in photoactive yellow protein (2006)
  • 著者名/発表者名: Shimizu, N., Kamikubo, H., Yamazaki Y., Imamoto, Y., Kataoka, M
  • 雑誌名: Biochemistry (in press)
• [雑誌論文] Conformational changes of PYP monitored by diffusion coefficient : Effect of N-terminal α-helices (2006)
  • 著者名/発表者名: Khan, J.S., Imamoto, Y., Harigai, M.Kataoka, M., Terazima, M
  • 雑誌名: Biophys.J. (in press)
• [雑誌論文] Non-destructive micro-patterning of protein crystals by focused femtosecond laser (2006)
  • 著者名/発表者名: Yoichiroh Hosokawa, Takahiro Kaji, Yuji Hiraki, Hajime Mori, Hiroshi Masuhara
  • 雑誌名: SPIE Proceeding (in press)
• [雑誌論文] pH-dependent equilibrium between long lived near-UV intermediates of photoactive yellow protein (2006)
  • 著者名/発表者名: Shimizu, N., Imamoto, Y., Harigai, M., Kamikubo, H., Yamazaki, Y., Kataoka, M.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 281(7) ページ: 4318-4325
• [雑誌論文] Time-resolved thermodynamics : Heat capacity change of transient species during photoreaction of PYP (2006)
  • 著者名/発表者名: Khan, J.S., Imamoto, Y., Kataoka, M., Tokunaga, F., Terazima, M
  • 雑誌名: J.Am.Chem.Soc. 128(3) ページ: 1002-1008
• [雑誌論文] Size and Phase Control in Quinacridone Nanoparticle Formation by Laser Ablation in Water (2006)
  • 著者名/発表者名: Teruki Sugiyama, Tsuyoshi Asahi, Hiroki Takeuchi, Hiroshi Masuhara
  • 雑誌名: Jpn.J.Appl.Phys. 45(1B) ページ: 384-388
• [雑誌論文] Fluorescence Evaluation of Antigen-Antibody Reactivity on Surface of Proteinaceous Occlusion Body : Toward Application in Reusable Protein Chip (2006)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Y.Yoshikawa, Yoichiroh Hosokawa, Kenji Suzuki, Keiko Ikeda, Hajime Mori, Hiroshi Masuhara
  • 雑誌名: Jpn.J.Appl.Phys. 45(1A) ページ: 323-327
• [雑誌論文] Explosive Crystallization of Urea Triggered by Focused Femtosecond Laser Irradiation (2006)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Y.Yoshikawa, Yoichiroh Hosokawa, Hiroshi Masuhara
  • 雑誌名: Jpn.J.Appl.Phys. 45(1) ページ: L23-L26
• [雑誌論文] Groove-spanning Behavior of Lipid Membranes on Microfabricated Silicon Substrates (2005)
  • 著者名/発表者名: Kenji Suzuki, Hiroshi Masuhara
  • 雑誌名: Langmuir 21(14) ページ: 6487-6494
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • 査読あり
• [雑誌論文] Spatial Control of Urea Crystal Growth by Focused Femtosecond Laser Irradiation (2005)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Y.Yoshikawa, Yoichiroh Hosokawa, Hiroshi Masuhara
  • 雑誌名: Crystal Growth & Design 6(1) ページ: 302-305
• [雑誌論文] Development of Near-Infrared 35 fs Laser Microscope and Its Application to the Detection of Three- and Four-Photon Fluorescence of Organic Microcrystals (2005)
  • 著者名/発表者名: Hirohisa Matsuda, Yousuke Fujimoto, Syoji Ito, Yutaka Nagasawa, Hiroshi Miyasaka, Tsuyoshi Asahi, Hiroshi Masuhara
  • 雑誌名: J.Phys.Chem.B 110(3) ページ: 1091-1094
• [雑誌論文] A biosensor in the time domain based on the diffusion coefficient measurement : intermolecular interaction of an intermediate of photoactive yellow protein (2005)
  • 著者名/発表者名: Khan JS, Imamoto Y, Yamazaki Y, Kataoka M, Tokunaga F, Terazima M.
  • 雑誌名: Anal Chem. 77(20) ページ: 6625-6629
• [雑誌論文] Femtosecond Laser-Induced Crystallization of 4-(Dimethylamino)-N-methyl-4-stilbazolium Tosylate (2005)
  • 著者名/発表者名: Yoichiro Hosokawa, Hiroaki Adachi, Masashi Yoshimura, Yusuke Mori, Takaytomo Sasaki, Hiroshi Masuhara
  • 雑誌名: Crystal Growth & Design 5(3) ページ: 861-863
• [雑誌論文] 光の散乱を捉え粒子の形状を見るレイリー散乱分光法 (2005)
  • 著者名/発表者名: 朝日 剛
  • 雑誌名: 化学 60(1) ページ: 12-17
• [雑誌論文] Angiogenesis Inhibitors Localized in Hypovascular Mesenchymal Tissues : Chondromodulin-I and Tenomodulin (2005)
  • 著者名/発表者名: Yuji Hiraki, Chisa Shukunami
  • 雑誌名: Connect.Tissue Res. 46(1) ページ: 3-11
• [雑誌論文] Chondromodulin-I and tenomodulin : a new class of tissue-specific angiogenesis inhibitors found in hypovascular connective tissues (2005)
  • 著者名/発表者名: Chisa Shukunami, Yusuke Oshima, Yuji Hiraki
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. 333(2) ページ: 299-307
• [図書] Nanoplasmonics : From Fundamentals to Applications (2006)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Masuhara, Tsuyoshi Asahi, Hiroyuki Yoshikawa, et al.
  • 総ページ数: 316
  • 出版者: Elsevier