| 研究課題/領域番号 |
16074217
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
城 宜嗣 独立行政法人理化学研究所, 城生体金属科学研究室, 主任研究員 (70183051)
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| 研究分担者 |
汲田 英之 独立行政法人理化学研究所, 城生体金属科学研究室, 協力研究員 (70332286)
日野 智也 独立行政法人理化学研究所, 城生体金属科学研究室, 基礎科学特別研究員 (40373360)
山田 斉爾 独立行政法人理化学研究所, 城生体金属科学研究室, 基礎科学特別研究員 (20360662)
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| キーワード | 金属酵素 / 一酸化窒素 / 脱窒 / 一酸化窒素還元酵素 / ヘム鉄 / 非ヘム鉄 |
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| 研究概要 |
金属イオンを活性中心に有するいくつかのタンパク質・酵素(金属タンパク質・金属酵素)を取り上げ、その分子構造、特に反応場である金属配位空間の精密な構造情報を基に、これらの生理活性や反応機構を分子レベルで理解することを目的に研究を進めた。研究対象としては、1.一酸化窒素還元酵素、2.酸素添加酵素、3.酸素センサータンパク質を取り上げている。本年度は、一酸化窒素還元酵素(Nitric Oxide Reductase : NOR)の反応機構解析に大きな進展があったので報告する。本研究では、脱窒菌Pseudomonas aeruginosaより膜蛋白質NORを高度に精製し、その中の4つの鉄すべてをFe^<2+>に還元した後にNOと反応させ、その際に生成する短寿命の反応中間体の電子状態ならびに配位酵素に注目した。反応追跡には、還元酵素とNO水溶液を混合した後に0.5〜10ミリ秒の時間で急速に凍結できる装置(大阪大学蛋白質研究所 高橋 聡助教授が設計作製したもの)をもちいて反応中間体の試料を調製し、ESRスペクトルを測定した。混合-凍結時間を0.5〜10ミリ秒に変えた試料、混合-凍結時間を0.5ミリ病に固定し試料の温度を変えたもの、一酸化炭素(CO)存在下での急速凍結試料などの測定の結果から、本酵素の触媒反応機構を提案した。この機構を、脱窒カビのNORの反応機構を詳細に比較検討した。また、この反応機構の構造的な裏付けを得るために、すなわちどのような配位空間で本反応が行われているのか分子レベルで理解する目的で、結晶構造解析を目指した単結晶作成も試みた。現在、約6Å分解能のX線回折像が得られる結晶を得ている。さらに分解能向上を目指して結晶化条件の検索を行っている。
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