研究課題
基盤研究(A)
中枢神経系をニューロンレベルからボトムアップに理解しようとするときに、決定的にかけている情報は「局所神経回路」の詳細である。これを解析する戦略として、細胞内染色法と遺伝子技術等を組み合せた「From one to many」の研究戦略により、以下の成果を得た。(1)蛍光顕微鏡下に生きたままGABA作動性ニューロンを観察できる遺伝子改変動物を用いて、ホールセルクランプにより細胞内染色する。この際、アダルト動物でのホールセルクランプが困難であるという問題を、GAD67/GFP knock-in mouseを用いた実験系でほぼ解決し、論文として報告した。現在この技術を用いて、VGAT/GFP BAC transgenic ratと逆行性標識法との組み合わせにより、皮質GABA作動性インターニューロンから皮質脊髄投射ニューロンへの入力を解析している。(2)lentivirusをトランスジェニック動物での遺伝子発現・タンパク質局在に関して良いモデルとして使えると考え、これを用いて8種類のtagged GFPを試みた。その結果、ニューロンの樹上突起をGolgi染色様に標識できるtagged GFP([myristoylation/palmitoylation site of Fyn]-[GFP]-[LDL receptor C-terminus]; myrGFP-LDLRCT)を開発できた。Thyl promoterとGAD67 promoter下にこのtagged GFPを発現するtransgenic mouseを作製してGFPのdendritic membrane targetingに成功したので論文として発表した。現在、より発現特異性の高いparvalbumin(PV)promoter等を用いたBAC transgenic mouseを作成中であり、PV/myrGFP-LDLRCT BAC transgenic mouseの作製に成功したところである。(3)大脳皮質の投射ニューロンをGolgi染色様に逆行性標識することをめざして、1)pesudorabies virus, 2)rabies virus glycoprotein(RVG)でpseudotypeにしたSindbis virus,あるいは3)RVG-pseudotypedlentivirus等の開発を行なっている。さらに、myrGFP-LDLRCT adenovirusを用いた逆行性標識の試み(高塩濃度下に注入)も行なって一定の成功を得ており、1個の錐体ニューロンから皮質視床投射ニューロンへの局所入力を解析している。また、tagged GFPの発現量を高めるためにTet-off systemの強力promoterを組み込んだadenovirusも開発している。(4)VGluT1およびVGluT2が皮質線条体入力と視床線条体入力に対応することを用いて、それぞれの線条体入力を電顕を用いて形態学的に解析した。この基礎データをもとに、Sindbis virusによるゴルジ染色様標識とVGluTの免疫染色を組み合わせて、1個の線条体ニューロンに対してどの程度の皮質入力(VGluT1)および視床入力(VGluT2)があるか、現在検討中である。
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