長期培養可能な機能細胞スフェロイドアレイの開発と代替動物実験への展開

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16300165
• 研究機関: 独立行政法人物質・材料研究機構
• 研究代表者: 大塚 英典 独立行政法人物質・材料研究機構, 生体材料研究センター, 主幹研究員 (00344193)
• 研究分担者: 宮原 裕二 独立行政法人物質・材料研究機構, 生体材料研究センター・ディレクター (20360399) ; 谷口 彰良 独立行政法人物質・材料研究機構, 生体材料研究センター・アソシエートディレクター (70256759) ; 小林 尚俊 独立行政法人物質・材料研究機構, 生体材料研究センター・アソシエートディレクター (90354266)
• キーワード: 生体適合性界面 / 微細加工 / マイクロパターニング / スフェロイド / 細胞アレイ / 肝機能 / 軟骨

研究概要

本研究では、材料表面に親水性高分子の周密ブラシ構造を構築した後に、微細加工技術を用いたナノ加工を行うことによってパターン化スフェロイドを作成する技術について詳細な検討を行った。前年度までの研究では、まず、細胞非接着性領域を効率的に形成させる手法として、従来より研究してきた親水性連鎖にポリエチレングリコール(PEG)を有するブロック共重合体の物理吸着法ではなく、化学的に安定なPEG表面を構築するため、片末端にメルカプト基を有するPEGを金表面上に固定化した。このような表面に微細加工を施すことによって細胞の接着性領域をマイクロオーダーでアレイ状に形成し、スフェロイドアレイを安定に培養できる最適条件を決定した。一方、スフェロイドパターニングの長期安定培養を目的とした場合、メルカプト基による単点型の金修飾では大気中室温下、高分子修飾表面の劣化によって細胞パターンの長期維持が不可能であることが問題となった。そこで、ピリジンユニットの多点吸着によって長期安定な基板修飾を可能とするPEG-ポリピリジングラフト共重合体を合成した。本目的を達成するためのグラフト共重合体の必要条件は、金・銀などの金属表面や半導体表面との多点結合によって、安定に表面固定化できるピリジン連鎖をバランス良く有することである。この要求を効率良く達成するため、methacryloyl-PEGマクロモノマーとメタクリロイルピリジンモノマーとの共重合比を任意に変化させた共重合体を合成し、PEGブラシ界面の長期間安定化を達成した。こうして作成したスフェロイドアレイ培養基盤は、機能性細胞の一つとして、肝細胞や軟骨細胞を選択するとスフェロイド形態と分化機能を長期に維持できることが判明した。
安定界面のさらなる展開として、窒化シリコン基板表面にDNA、ペプチド、蛋白質などの生体分子を固定化する方法の最適化を行い、x線光電子分光(XPS)などを用いて分子配向性に関する研究を推進した。アミノシラン、チオールを末端に有する界面分子を用いて生体分子を固定化し、同時角度分解XPSにより表面からの深さ方向の情報を取得することにより、機能性界面分子の配向性を評価することができた。

研究成果

• [雑誌論文] Mulitiarray Formation of Cell Spheroids on a Microfabricated PEG-Brush Surface and Their Stabilization of Tissue Like Functions. (2006)
  • 著者名/発表者名: Otsuka, H., Kataoka, K.
  • 雑誌名: Bioindustry 23(1) ページ: 23-30
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Synthesis of Polypyridine-graft-PEG Copolymer for Protein Repellent and Stable Interface. (2006)
  • 著者名/発表者名: Satomi, T., Ueno, K., Kobayashi, H., Tanaka, J., Tateishi, T., Otsuka, H.
  • 雑誌名: J.Nanosci.Nanotech. (In press)
• [雑誌論文] Activation of lymphocyte proliferation by boronate-containing polymer immobilized on substrate ; the effect of boron content on lymphocyte proliferation (2006)
  • 著者名/発表者名: T Ikeya, H Otsuka, T Okano, K Kataoka
  • 雑誌名: Eur.Cell & Mater. (In press)
• [雑誌論文] Tripodal Thiol-Derivatives as a Functional Interface Monolayer for Immobilization of Biomolecules. (2005)
  • 著者名/発表者名: Sakata, T., Miyahara, Y., Maruyama, S., Otsuka, H.
  • 雑誌名: IEEE EMBS ページ: 215-218
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 高感度センサーを目指したポリエチレングリコール修飾金コロイド担持表面の構築 (2005)
  • 著者名/発表者名: 石井 武彦, 鈴木 祐子, 秋山 好嗣, 大塚 英典, 片岡 一則, 長崎 幸夫
  • 雑誌名: 高分子論文集 62(2) ページ: 81-86
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 電界効果トランジスタを用いた遺伝子解析チップ (2005)
  • 著者名/発表者名: 宮原裕二, 坂田利弥
  • 雑誌名: ケミカルエンジニアリング 50 ページ: 508-514
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 半導体技術を用いたバイオチップ (2005)
  • 著者名/発表者名: 宮原裕二
  • 雑誌名: マテリアルインテグレーション 18 ページ: 50-54
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 半導体遺伝子解析チップの開発と臨床診断への応用 (2005)
  • 著者名/発表者名: 宮原裕二
  • 雑誌名: Bioclinica 20 ページ: 32-36
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Two-dimensional Array Formation of Multi-Cellular Spheroids on Micro-patterned Polymer Brush Surfaces. (2005)
  • 著者名/発表者名: Otsuka, H., Satomi, T., Hirano, A., Nagasaki, Y., Kataoka
  • 雑誌名: Key Engineering Materials vols.288-289 ページ: 449-452
• [雑誌論文] A Reactive Poly(ethylene glycol) Layer To Achieve Specific Surface Plasmon Resonance Sensing with a High S/N Ratio : The Substantial Role of a Short Underbrushed PEG Layer in Minimizing Nonspecific Adsorption. (2005)
  • 著者名/発表者名: Uchida, K., Otsuka, H., Kaneko, M., Kataoka, K., Nagasaki, Y
  • 雑誌名: Anal.Chem. 77(4) ページ: 1075-1080
• [雑誌論文] Ligand Density Effect on Biorecognition by PEGylated Gold Nanoparticles : Regulated Interaction of RCA_<120> Lectin with Lactose Installed to the Distal End of Tethered PEG Strands on Gold Surface. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takae, S., Akiyama, Y., Otsuka, H., Nakamura, T., Nagasaki, Y., Kataoka, K.
  • 雑誌名: Blomacromolecules 6(2) ページ: 818-824
• [雑誌論文] Potential behavior of bio-chemically modified gold electrode for extended gate field effect Transistor (2005)
  • 著者名/発表者名: T.Sakata, S.Matsumoto, Y.Nakajima, Y.Miyahara
  • 雑誌名: Japanese Journal of Applied Physics 44 ページ: 2860-2863
• [雑誌論文] DNA analysis chip based on field effect transistors (2005)
  • 著者名/発表者名: T.a Sakata, M.Kamahori, Y.Miyahara
  • 雑誌名: Japanese Journal of Applied Physics 44 ページ: 2854-2859
• [雑誌論文] Potentiometric detection of single nucleotide polymorphism by using a genetic field effect transistor (2005)
  • 著者名/発表者名: T.Sakata, Y.Miyahara
  • 雑誌名: ChemBioChem 6 ページ: 703-710
• [雑誌論文] Detection of DNA recognition events using multi-well field effect devices (2005)
  • 著者名/発表者名: T.Sakata, Y.Miyahara
  • 雑誌名: Biosensors and Bioelectronics 21 ページ: 827-832
• [雑誌論文] Bio-molecular embossing (2005)
  • 著者名/発表者名: J.P.Hulme, J.G.Gwak, Y.Miyahara
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 128 ページ: 390-391
• [雑誌論文] バイオトランジスタによる生体分子認識反応の電気的検出 (2005)
  • 著者名/発表者名: 坂田利弥, 宮原裕二
  • 雑誌名: 応用物理 74 ページ: 1555-1562
• [図書] 再生医療のためのバイオエンジニアリング、10章、高分子界面設計と細胞・組織(スフェロイド)エンジニアリング. (2006)
  • 著者名/発表者名: 大塚英典
  • 出版者: コロナ社
• [図書] 有機トランジスタ材料の評価と応用 (2005)
  • 著者名/発表者名: 宮原裕二(分担)
  • 総ページ数: 190
  • 出版者: シー・エム・シー出版
• [図書] ナノマテリアルハンドブック (2005)
  • 著者名/発表者名: 宮原裕二, 丸山純夫, 坂田利弥(分担)
  • 総ページ数: 807
  • 出版者: NTS出版