長期培養可能な機能細胞スフェロイドアレイの開発と代替動物実験への展開

2006 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16300165
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 大塚 英典 東京理科大学, 理学部第一部応用化学科, 淮教授 (00344193)
• 研究分担者: 宮原 裕二 物質材料研究機構, 生体材料センター, グループリーダー (20360399) ; 谷口 彰良 物質材料研究機構, 生体材料センター, グループリーダー (70256759) ; 小林 尚俊 物質材料研究機構, 生体材料センター, グループリーダー (90354266)
• キーワード: 生体適合性界面 / 微細加工 / マイクロパターニング / スフェロイド / 細胞アレイ / 肝機能

研究概要

生理活性物質を固定化した表面上への光反応性高分子材料によるマイクロパターニングを行った:水溶性を有する光反応基を導入した親水性高分子を新規に合成し、あらかじめ生理活性物質を固定化した表面上にマイクロパターンを形成することを試みた。具体的には、細胞接着を促進するコラーゲンを前固定した基板上に、新規高分子を用いてマイクロパターニングを行った後、下地コラーゲンの状態及び細胞接着性について、免疫染色等を用いて評価した。一方、より優れた細胞接着抑制能を有すると期待される新規光反応性高分子材料について、このポリマーの製膜特性、細胞接着抑制能、スフェロイドパターンの維持性、などに関して評価を行った。
コラーゲン上への直接パターン形成を試みた結果、位相差顕微鏡観察から良好なパターンが作成可能であることが示された。また、血管内皮細胞を用いてパターン形成能、細胞接着性にっいて評価したところ、パターンが良好に形成されるのはもちろんのこと、コラーゲンを有さないサンプルと比較して細胞の接着強度が有意に向上していることが確認された。本結果はポリリジン、アミノ基含有シランカップリング剤の修飾基盤によっても同様に達成されることが明らかとなった。特に効率的にスフェロイドを誘導する表面設計手法の指針と環境安定性を有する表面の構築方法について得た基礎的知見をさらに、ハイスループットな細胞アッセイ系へと展開できた。その結果、96wellプレート内でのスフェロイドアレイ培養に成功した。
スフェロイドの生化学的機能解析として、アルブミン産生能の維持について検討した。この際、サイズの異なるスフェロイドを調製することで、サイズ(構造)と機能の相関についてあわせて検討した。サンドイッチELISA法を用いてアルブミン産生量を算出し、細胞あたりのアルブミン産生量を算出したところ、100μmのスフェロイドが最も良好な結果を示した。また、産生量は一ヶ月以上にわたってほぼ一定の値を保った。この結果に基づき、ドメインサイズ100μmのスフェロイドを用い、テストステロン6β部位特異的水酸化反応にかかわるシトクロムP450 3A1および3A2(CYP3A1/2)の活性を測定したところ、二週間にわたってスフェロイド形成直後の活性を維持することが示された。さらにこのようなスフェロイドの生化学的機能を遺伝子レベルで詳細に解析する方法論を確立した。現在、細胞や細胞集団の長期培養・高機能化、さらには複雑な臓器の再生の戦略を考えるための基礎的知見があまりにも乏しいため、細胞集団が他の細胞集団とどのように相互作用しているかはほとんど明らかになっていない。そこで、本年度は細胞シート工学を用い、異なった細胞集団を2層化する培養システムで異種細胞間の相互作用を遺伝子レベルで解析するシステムを構築した。これにより、スフェロイド内遺伝子発現を効率的に解析することに成功した。

研究成果

• [雑誌論文] Direct transduction of allele-specific primer extension into electrical signal using genetic field effect transistor (2007)
  • 著者名/発表者名: Toshiya Sakata, Yuji Miyahara
  • 雑誌名: Biosensors and Bioelectronics 22 ページ: 1311-1316
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Stable Immobilization of an Oligonucleotide Probe on a Gold Substrate Using Trpodal Thiol Derivatives. (2007)
  • 著者名/発表者名: Toshiya Sakata, Sumio Maruyama, Aiko Ueda, Hidenori Otsuka, Yuji Miyahara
  • 雑誌名: LAngmuir Vol.23,No.5 ページ: 2269
• [雑誌論文] Density control of Poly(ethyleneglycol) layer to regulate cellular attachment (2007)
  • 著者名/発表者名: Tomomi Satomi, Yukio Nagasaki, Hisatoshi Kobayashi, Hidenori Otsuka, Kazunori Kataoka
  • 雑誌名: Langmuir (In press)
• [雑誌論文] Microkeratome assisted deep lamellar keratoprosthesis. (2007)
  • 著者名/発表者名: S Shimmura, H Miyashita, Y Uchino, T Taguchi, H Kobayashi, J Shimazaki, J Tanaka, K Tsubota
  • 雑誌名: British Journal of Ophthalmology 90 ページ: 826-829
• [雑誌論文] Cell adhesion characteristics to chemically modified silicon nitride surface (2007)
  • 著者名/発表者名: Toshiya Sakata, Aiko Ueda, Yuji Miyahara
  • 雑誌名: IEEJ Transactions on Electrical and Electronic Engineering (in press)
• [雑誌論文] Nano-fabricated aligned spheroid for cartilage tissue engineering. (2006)
  • 著者名/発表者名: H.Otsuka, T.Satomi, K.Ueno, T.Tateishi
  • 雑誌名: Biomed. Appl. Nano Technol., Adv. Sci. Technol. 53 ページ: 67-69
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] DNA sequencing based on intrinsic molecular charges (2006)
  • 著者名/発表者名: Toshiya Sakata, Yuji Miyahara
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International Edition 45 ページ: 2225-2228
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Bio-molecular embossing (2006)
  • 著者名/発表者名: John P.Hulme, Jihye Gwak, Yuji Miyahara
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 128 ページ: 390-391
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] ACTIVATION OF LYMPHOCYTE PROLIFERATION BY BORONATE-CONTAININGPOLYMER IMMOBILISED ON SUBSTRATE : THE EFFECT OF BORON CONTENTON LYMPHOCYTE PROLIFERATION. (2006)
  • 著者名/発表者名: Hidenori Otsuka, Takeshi Ikeya, Teruo Okano, Kazunori Kataoka.
  • 雑誌名: European Cells and Materials 12 ページ: 36-43
• [雑誌論文] Synthesis of Polypyridine-graft-PEG Copolymer for Protein Repellent and Stable Interface. (2006)
  • 著者名/発表者名: Satomi, Tomomi, Ueno, Koji, Fujita, Yohei, Kobayashi, Hisatoshi, TAnaka, Junzo, Mitamura, Yoshinori, Takeishi, Tetsuya, Otsuka, Hidenori
  • 雑誌名: Journal of Nanoscience and Nanotechnology Volume 6, Number 6 ページ: 1792-1796(5)
• [雑誌論文] Physicochemical Characterization of Densely Packed Poly(ethyleneglycol) Layer for Minimizing Nonspecific Protein Adsorption (2006)
  • 著者名/発表者名: Tomomi Satomi, Yukio Nagasaki, Hisatoshi Kobayashi, Tetsuya Tateishi, Hidenori Otsuka
  • 雑誌名: Journal of Nanoscience and Nanotechnology
• [雑誌論文] Characterization of Polypyridine-graft-PEG Copolymer at Interface (2006)
  • 著者名/発表者名: Tomomi Satomi, Koji Ueno, Yohei Fujita, Hisatoshi Kobayashi, Tetsuya Tateishi, Hidenori Otsuka
  • 雑誌名: J. Jpn. Soc. Colour Mater. 79(11) ページ: 475-482
• [雑誌論文] Mulitiarray Formation of Cell Spheroids on a Microfabricated PEG-Brush Surface and Their Stabilization of Tissue Like Functions (2006)
  • 著者名/発表者名: Otsuka.H, Kataoka, K
  • 雑誌名: Bioindustry, 23(1) ページ: 23-30.
• [雑誌論文] Construction of nano-biointerface to control cell function and behabior (2006)
  • 著者名/発表者名: Otsuka, H.
  • 雑誌名: Journal Japanese Society for Biomaterials 24(2) ページ: 115-121
• [雑誌論文] Contorl of Interfacial Properties for Biomedical Applications (2006)
  • 著者名/発表者名: Y.fujita, H.Otsuka
  • 雑誌名: J. Jpnb. Soc. Colour Mater. 79(12). ページ: 555-560
• [雑誌論文] Physicochemical characterization of the Py-g-PEG copolymer at the interface (2006)
  • 著者名/発表者名: Fujita, Y, Ueno, K, Satomi, T, Yajima, H, Otsuka, H.
  • 雑誌名: Trans. Mater. Res. Soc. Jpn. 31(3) ページ: 649-653
• [雑誌論文] Uniformly size-controled chondrocyte spheroid array and evaluation of its function (2006)
  • 著者名/発表者名: Satomi, T, Kobayashi, H, Tanaka, J, Nagasaki, Y, Mitamura, Y, Tateishi, T, Kataoka, K, Otsuka, H.
  • 雑誌名: Trans. Mater. Res. Soc. Jpn. 31(3) ページ: 655-658
• [雑誌論文] Synthesis of polypyridine-graft-PEG copolymer for long-term stability of nonfouling character (2006)
  • 著者名/発表者名: Otsuka, H, Satomi, T, Ueno, K, Mitamura, Y, Tateishi, T.
  • 雑誌名: Trans. Mater. Res. Soc. Jpn. 31(3) ページ: 627-631
• [雑誌論文] Development of spheroid array with long-term cell viability for biomedical application : novel molecular design for cellular array fabrication. (2006)
  • 著者名/発表者名: Otsuka, H, Satomi, T, Ueno, K, Suzuki, S, Enosawa, S, Kobayashi, H, Kataoka, K, Tanaka
  • 雑誌名: J. TISSUE ENGINEERING 12(4), ページ: 1061-1061
• [雑誌論文] The exon 6ABC region of amelogenin mRNA contribute to increased levels of amelogenin mRNA through amelogenin protein-enhanced mRNA stabilization. (2006)
  • 著者名/発表者名: Xu, L, Harada, H, Taniguchi, A
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 281 ページ: 32439-32444
• [雑誌論文] Preferential reduction of the alpha-2,6-sialylation from cell surface N-glycans. (2006)
  • 著者名/発表者名: Tomomi Tadokoro, Kiyotaka Yamamoto, Iku Kuwahara, Hirosuke Fujisawa, Masahiko Ikekita, Akiyoshi Taniguchi, Takeshi sato, Kiyoshi Furukawa
  • 雑誌名: Glycoconjugate J. 23 ページ: 443-452
• [雑誌論文] Reuptake of extracellular amelogenin bu dental epithelial cells results in increased levels of amelogenin mRNA through enhanced mRNA stabilization. (2006)
  • 著者名/発表者名: Xu L, Harada, H, Tamaki, Y-T, Matsuumoto, S, Tanaka, J, Taniguchi, A
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 281 ページ: 2257-2262
• [雑誌論文] Effects of carbocisteine on sialyl-Lewis x expression in NCI-H292 cells, an airway carcinoma cell line, stimulated with tumor necrosis factor-α. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ishibashi.Y, Inouye, Y, Okano, T, Taniguchi, A
  • 雑誌名: Eur. J. Pharmacol. 530 ページ: 223-228
• [雑誌論文] Identification of Differentially Expressed Genes in Hepatocyte/Endothelial Cell Co-culture System. (2006)
  • 著者名/発表者名: Takayama, G, Taniguchi, A, Okano, T.
  • 雑誌名: Tissue Eng. 13 ページ: 159-166
• [雑誌論文] The injectable drug delivery system for anticancer chemotherapy using the novel tissue adhesive : Characterization and in vitro evaluation (2006)
  • 著者名/発表者名: Kakinoki S, Taguchi T, Kobayashi H, Tanaka J.
  • 雑誌名: TISSUE ENGINEERING 12(4) ページ: 1077-1077 273
• [雑誌論文] Synthesis of novel crosslinkers for promoting spheroid formation (2006)
  • 著者名/発表者名: Ito M, Taguchi T, Kakinoki S, Kobayashi H, Tanaka J.
  • 雑誌名: TISSUE ENGINEERING 12(4) ページ: 1078-1078 275
• [雑誌論文] In vivo evaluation of comeal epithelium stability on collagen-immobilized PVA and amniotic-membrane hybridized PVA as an artificial cornea. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi H, Kato M, Taguchi T, Shimmura S, Miyashita H, Tsubota K, Tanaka J.
  • 雑誌名: TISSUE ENGINEERING 12(4) ページ: 1098-1099 337
• [雑誌論文] Biocompatible high-strength glue consisting of citric acid derivative and collagen. (2006)
  • 著者名/発表者名: Taguchi T, Saito H, Aoki H, Uchida Y, Sakane M, Kobayashi H, Tanaka J.
  • 雑誌名: MATERIALS SCIENCE ＆ ENGINEERING C-BIOMIMETIC AND SUPRAMOLECULAR SYSTEMS 26(1) ページ: 9-13
• [雑誌論文] Collagen-immobilized poly(vinyl alcohol) as an artificial cornea scaffold that supports a stratified corneal epithelium. (2006)
  • 著者名/発表者名: Miyashita H, Shimmura S, Kobayashi H, Taguchi T, Asano-Kato N, Uchino Y, Kato M, Shimazaki J, Tanaka J, Tsubota K.
  • 雑誌名: JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH PART B-APPLIED BIOMATERIALS 76B(1) ページ: 56-63
• [図書] 再生医療のためのバイオエンジニアリング.高分子界面設計と細胞・組織(スフェロイド)エンジニアリング,6章 (2007)
  • 著者名/発表者名: 大塚英典, 片岡一則
  • 総ページ数: 114-128
  • 出版者: コロナ社(2007年4月12日).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] ナノテクノロジー入門シリーズII, ナノテクのための化学・材料入門,chapter2, 高次構造 : ミセル,コロイド,ナノファイバー (2007)
  • 著者名/発表者名: 大塚英典, 片岡一則
  • 総ページ数: 36-64
  • 出版者: 共立出版(2007年3月30日).
• [図書] 機能性材料 (2007)
  • 著者名/発表者名: 宮原裕二, 坂田利弥, 松元亮
  • 総ページ数: 25-34
  • 出版者: 遺伝子解析用バイオトランジスタ.
• [図書] バイオセンサとバイオチップ (2006)
  • 著者名/発表者名: 堀池靖浩, 宮原裕二
  • 出版者: 共立出版
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] DNA マイクロフルイディックシステム、「バイオセンサ・ケミカルセンサ辞典」、(軽部征夫 監修) (2006)
  • 著者名/発表者名: 宮原裕二
  • 出版者: テクノシステム
• [図書] ナノテクノロジーと臨床検査 (2006)
  • 著者名/発表者名: 宮原裕二
  • 総ページ数: 1334-1340
  • 出版者: 臨床検査,50
• [図書] 電界効果トランジスタによる生体分子認識の電気的検出 (2006)
  • 著者名/発表者名: 宮原裕二, 坂田利弥
  • 総ページ数: 13-20
  • 出版者: 表面科学,27