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2005 年度 実績報告書

バキュロウイルスディスプレイによる膜タンパク質複合体解析

研究課題

研究課題/領域番号 16310147
研究機関東京大学

研究代表者

浜窪 隆雄  東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (90198797)

研究分担者 先浜 俊子  東京大学, 先端科学技術研究センター, 科学技術振興特任教員(特任助教授) (70187061)
増田 一之  東京大学, 先端科学技術研究センター, 科学技術振興特任教員(特任助手) (20345151)
キーワード核内受容体 / 磁性ビーズ / プロテオミクス / 転写複合体 / HNF4α
研究概要

発芽型バキュロウイルス(BV)に発現した膜タンパク質は、GPCR(BLT1,CCR2,CCR5,edg1,AT1a,AT2,D1,D5),アデニレートシクラーゼ、γセクレターゼ複合体(プレセニリン、ニカストリン、APH1,PEN2)、ペプチドトランスポーター(PepT1)である。ケモカイン受容体を除いてすべてBV画分に高い活性を回収した。BLT1-BVでは、リガンドのLTB4を蛍光標識することによりBVでの結合アッセイを開発し、ドパミン受容体では、三量体Gタンパク質とアデニレートシクラーゼを共感染することにより、BV上でリガンド依存性のCAMP産生シグナルが計測され、再構成できることが示された。γセクレターゼはBV上で活性型プレセニリンが再構成され、上記4種の膜タンパク質がC99からβアミロイドの生成に必要十分であることが示された。これらのBVをウイルスエンベロープタンパク質gp64トランスジェニックマウスに免疫することにより、CCR2,CCR5,edg1,ニカストリン、PepT1に対する特異モノクローナル抗体が作製でき、また機能を阻害する抗体や癌細胞に対してADCC活性を有する機能性抗体が得られることがわかった。得られたニカストリン抗体は、未変性のニカストリンのN端を認識し、γセクレターゼ複合体がコレステロールラフトに活性型としてコレステロール依存性に分布すること、またニカストリンが構造的にγセクレターゼ複合体の端に位置していることなどが示された。膜貫通領域での加水分解の機構を説明するモデルを示唆するものである。またGi-CFPとRGS10-YFPをリンカーでつなぐことにより、A1F刺激によりFRETを起こすプローブの作製に成功した。これらの結果は、BV上での膜タンパク質の発現系が膜タンパク質複合体解析に有用であることを示すものであると考えられた。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2006 2005

すべて 雑誌論文 (7件)

  • [雑誌論文] Three-dimensional structure of the γ-secretase complex.2006

    • 著者名/発表者名
      Ogura T, Mio M, Hayashi I, Miyashita H, Fukuda R, Kodama T, Hamakubo T, Iwastubo T, Tomita T, sato C
    • 雑誌名

      Biochemical and Biophysical Research Communications (印刷中)

  • [雑誌論文] A simple hybridoma screening method for high-affinity monoclonal antibodies using the signal ratio obtained from time-resolved fluorescence assay.2006

    • 著者名/発表者名
      Daigo K, Sugita S, Mochizuki Y, Iwanari H, Hiraishi K, Miyano K, Kodama T, Hamakubo T.
    • 雑誌名

      Anal Biochem. (印刷中)

  • [雑誌論文] Dysregulated expression of P1 and P2 promoter-driven hepatocyte nuclear factor-4alpha in the pathogenesis of human cancer.2006

    • 著者名/発表者名
      Tanaka T, Jiang S, Hamakubo T, Sakai J, Naito M, Kodama T.
    • 雑誌名

      J Pathol. (印刷中)

  • [雑誌論文] Recovery of functional peptide transporter PepT1 in budded baculovirus fraction.2005

    • 著者名/発表者名
      Saitoh R, Ohtomo T, Ito Y, Nezu J, Kimura N, Funahashi S, Aso Y, Ohizumi I, Kodama T, Hamakubo T
    • 雑誌名

      Protein Expr Purif September 26

      ページ: 130-135

  • [雑誌論文] Histone methyltransferases G9a and GLP form heteromeric complexes and are both crucial for methylation of euchromatin at H3-K9.2005

    • 著者名/発表者名
      Tachibana M, Ueda J, Fukuda M, Takeda N, Ohta T, Iwanari H, Sakihama T, Kodama T, Hamakubo T, Shinkai Y.
    • 雑誌名

      Genes Dev. April 1;19

      ページ: 815-826

  • [雑誌論文] Association of active gamma -secretase complex with lipid rafts.2005

    • 著者名/発表者名
      Urano Y, Hayashi I, Isoo N, Reid PC, Shibasaki Y, Noguchi N, Tomita T, Iwatsubo T, Hamakubo T, Kodama T.
    • 雑誌名

      J Lipid Res. May46(5)

      ページ: 904-912

  • [雑誌論文] Expression of the LXR{alpha} Protein in Human Atherosclerotic Lesions2005

    • 著者名/発表者名
      Watanabe Y, Jiang S, Takabe W, Ohashi R, Tanaka T, Uchiyama Y, Katsumi K, Iwanari H, Noguchi N, Naito M, Hamakubo T, Kodama T
    • 雑誌名

      Arterioscler Thromb Vasc Biol. March 25

      ページ: 622-627

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公開日: 2007-04-02   更新日: 2016-04-21  

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