研究課題
基盤研究(B)
1.非天然アミノ酸専用tRNA(酵母チロシンサプレッサ-tRNA)が極僅かながら大腸菌リジルtRNA合成酵素によりミスアシル化される問題の解決を図り、tRNA分子内に遺伝子工学的に変異を導入することでミスアシル化を1/10以下に抑えたtRNA変異体の取得に成功した。また、酵母チロシル-tRNA合成酵素を遺伝子工学的に改変して、よりAmberサプレッサーtRNAに適合した変異体を取得することに成功した。2.酵母ミトコンドリア由来のトリプトファンtRNAをOpalサプレッサーtRNAとして利用する可能性を見いだした。また、酵母ミトコンドリアTrpRSの遺伝子工学的改変を行い、インドール環の7位にメチル基をもつトリプトファンアナログが受容できるmt TrpRS改変体F38Aを取得することにも成功した。3.モデルタンパク質としてカルモデュリンを選び、分子内の特定部位に3-アジドチロシンを導入した上で種々のトリアリルフォスフィン誘導体(蛍光発色団、ビオチン、ポリエチレングリコール等)との反応により部位特異的修飾を行った。また、分子内の特定部位を1分子1蛍光標識したカルモデュリンを調製し、蛍光相関分光法によりカルモデュリン結合タンパク質との相互作用を解析した。4.X線結晶構造解析の重要な支援技術として、SAD法に適した3-ヨードチロシンを分子内特定部位に導入したタンパク質を過剰発現させ、mg単位で精製することに成功した。現在これらの結晶化とX線結晶解析が進められている。なお、これに関連して酵母チロシル-tRNA合成酵素(野生型)のX線結晶解析にも成功した。今後3-ヨードチロシンを導入した変異型酵素(Y43G等)についてもSAD法によりX線結晶解析を行う予定である。
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