医薬小分子のアフィニティによる結合タンパク質の決定

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16310155
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 菅原 二三男 東京理科大学, 理工学部, 教授 (30192123)
• キーワード: 結合タンパク質 / ファージディスプレイ / 抗癌剤 / カンプトテシン / プロスタグランディン / G-タンパク質 / 表面プラズモン共鳴 / クオーツマイクロバランス振動法

研究概要

受容体あるいは結合タンパク質など、インビボでの医薬標的分子を決定するためには、最適な細胞株を選択して培養し、決定しなければならない。それは受容体を標的に設計・探索した場合でも、真の選択性を立証するためには絶対欠かせない要件であるが、多くの困難が伴うことはほとんどの研究者が経験してきたことである。ファージディスプレイは、リガンド(医薬候補化合物)に結合するペプチドをファージの外殻コートタンパク質に提示させ、そのアミノ酸配列をDNA配列から読み取る方法であり、標的分子をインビトロで決定できる可能性を持っている。
本研究では、抗癌剤カンプトテシンを有機化学反応でビオチン誘導体とし、T7ファージに提示された結合アミノ酸配列を解析した。その結果、NSSQSARRを結合配列として得ることに成功し、表面プラズモン共鳴(SPR)およびクオーツマイクロバランス振動法(QCM)で結合定数(KD)0.1micro Mを得た。この配列は、プロスタグランディンE2(PGE2)の7回膜貫通型G-タンパク質受容体EP1の細胞内第3ループ(228A-294E)と相同性を示した。そこで、大腸菌に組替えて発現したドメイン(228A-294E)と、カンプトテシンの結合定数(KD)を解析し、0.01micro Mを得た。
これまで言われてきたカンプトテシンによるDNA topoisomerase Iの阻害濃度は1mili M程度なので、ここにカンプトテシンの新たな受容体を決定することに成功した。このように、小分子リガンドを使用するT7ファージディスプレイ法には、これらの結果から結合アミノ酸配列を決定する方法として十分な可能性を示しているが、さらに信頼性の向上と偽陽性の排除が求められる。

研究成果

• [雑誌論文] Alpha-sulfoquinovosylmonoacylglycerol is a novel potent radiosensitizer targeting tumor angiogenesis. (2006)
  • 著者名/発表者名: Sakimoto I, Ohta K, Yamazaki T, Ohtani S, Sahara H, Sugawara F, Sakaguchi K, Miura M.
  • 雑誌名: Cancer Res. 66・4 ページ: 2287-2295
• [雑誌論文] Abstract Structural relationship of curcumin derivatives binding to the BRCT domain of human DNA polymerase lambda. (2006)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi T, Ishidoh T, Iijima H, Kuriyama I, Shimazaki N, Koiwai O, Kuramochi K, Kobayashi S, Sugawara F, Sakaguchi K, Yoshida H, Mizushina Y.
  • 雑誌名: Genes Cells. 11・3 ページ: 223-235
• [雑誌論文] A high-throughput phage display screening method using a combination of real-time PCR and affinity chromatography (2006)
  • 著者名/発表者名: Morohashi K, Arai T, Saito S, Watanabe M, Sakaguchi K, Sugawara F.
  • 雑誌名: Comb Chem High Throughput Screen 9・1 ページ: 55-61
• [雑誌論文] 5-(Hydroxyraethyl)-2-furfural : a selective inhibitor of DNA polymerase lambda and terminal deoxynucleotidyltransferase. (2006)
  • 著者名/発表者名: Mizushina Y, Yagita E, Kuramochi K, Kuriyama I, Shimazaki N, Koiwai O, Uchiyama Y, Yomezawa Y, Sugawara F, Kobayashi S, Sakaguchi K, Yoshida H.
  • 雑誌名: Arch Biochem Biopnys. 446・1 ページ: 69-76
• [雑誌論文] Effective form of sulfoquinovosyldlacyglycerol(SQDG) vesicles for DNA polymerase inhibition. (2005)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto K, Sakai H, Takeuchi R, Tsuchiya K, Ohta K, Sugawara F, Abe M, Sakaguchi K.
  • 雑誌名: Colloids Surf B Biointerfaces. 46・3 ページ: 175-181
• [雑誌論文] Sulfo-quinovosyl-acyl-glycerol(SQAG), a eukaryotic DNA polymerase inhibitor and anti-cancer agent. (2005)
  • 著者名/発表者名: Mizushina Y, Kasai N, Iijima H, Sugawara F, Yoshida H, Sakaguchi K.
  • 雑誌名: Curr Med Chem Anticancer Agents 5・6 ページ: 613-625
• [雑誌論文] Abstract Monoacetylcurcumin : a new inhibitor of eukaryotic DNA polymerase lambda and a new ligand for inhibitor-affinity chromatography. (2005)
  • 著者名/発表者名: Mizushina Y, Ishidoh T, Takeuchi T, Shimazaki N, Koiwai O, Kuramochi K, Kobayashi S, Sugawara F, Sakaguchi K, Yoshida H.
  • 雑誌名: Biochem Biopnys Res Commun. 337・4 ページ: 1288-1295
• [雑誌論文] (2005)
  • 著者名/発表者名: Takakusagi Y, Onta K, Kuramochi K, Morohashi K, Kobayashi S, Sakaguchi K, Sugawara F.
  • 雑誌名: Bioorg Med Chem Lett. 15・21 ページ: 4846-4849
• [雑誌論文] Sulfoquinovosylmonoacylglycerol inhibitory mode analysis of rat DNA polymerase beta. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kasai N, Mizushina Y, Murata H, Yamazaki T, Ohkubo T, Sakaguchi K, Sugawara F.
  • 雑誌名: FEBS J. 272・17
• [雑誌論文] Camptotnecin binds to a synthetic peptide identified by a T7 phage display screen. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takakusagi Y, Kobayasni S, Sugawara F.
  • 雑誌名: Bioorg Med Chem Lett. 15・21 ページ: 4850-4853
• [雑誌論文] Selective inhibitors of terminal deoxyribonucleotidyltransferase(TdT) : baicalin and genistin. (2005)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama Y, Tagami J, Kamisuki S, Kasai N, Oshige M, Chiku H, Ibe S, Koiwai O, Sugawara F, Sakaguchi K.
  • 雑誌名: Biochim Biophys Acta. 1725・3
• [雑誌論文] Structural analysis of catechin derivatives as mammalian DNA polymerase inhibitors. (2005)
  • 著者名/発表者名: Mizushina Y, Saito A, Tanaka A, Nakajima N, Kuriyama I, Takemura M, Takeuchi T, Sugawara F, Yoshida H.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 333・1 ページ: 101-109
• [雑誌論文] Structural analysis of isosteviol and related compounds as DNA polymerase and DNA topoisoraerase inhibitors. (2005)
  • 著者名/発表者名: Mizushina Y, Akihisa T, Ukiya M, Hamasaki Y, Murakami-Nakai C, Kuriyama I, Takeuchi T, Sugawara F, Yoshida H.
  • 雑誌名: Life Sci. 77.17 ページ: 2127-2140
• [雑誌論文] The entrapment of kojic oleate in bilayer vesicles (2005)
  • 著者名/発表者名: Manosroi A, Wongtrakul P, Manosroi J, Midorikawa U, Hanyu Y, Yuasa M, Sugawara F, Sakai H, Abe M.
  • 雑誌名: Int J Pharm. 298・1 ページ: 13-25
• [雑誌論文] Inhibition of CD62L+ T-cell response in vitro via a novel sulfo-glycolipid, beta-SQAG9 liposome that binds to CD62L molecule on the cell surface. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto Y, Sahara H, Takenouchi M, Matsumoto Y, Imai A, Fujita T, Tamura Y, Takahashi N, Gasa S, Matsumoto K, Ohta K, Sugawara F, Sakaguchi K, Jimbow K, Sato N.
  • 雑誌名: Cell Immuno 232・1-2 ページ: 105-115
• [雑誌論文] Identification of a drug target motif : an anti-tumor drug NK109 interacts with a PNxxxxP. (2005)
  • 著者名/発表者名: Morohashi K, Yoshino A, Yoshimori A, Saito S, Tanuma S, Sakaguchi K, Sugawara F.
  • 雑誌名: Biochem Pharmacol. 70・1 ページ: 37-46
• [雑誌論文] Mammalian mitotic centromere-associated kinesin(MCAK) : a new molecular target of sulfoquinovosylacylglycerols novel antitumor and immunosuppressive agents. (2005)
  • 著者名/発表者名: Aoki S, Ohta K, Yamazaki T, Sugawara F, Sakaguchi K.
  • 雑誌名: FEBS J. 272・9 ページ: 2132-2140
• [雑誌論文] Mechanism of the immunosuppressive effect in vivo of novel Immunosuppressive drug beta-SQAG9, which nhibits the response of the CD62L+T-cell subset. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takenouchi M, Sahara H, Yamaiaoto Y, Matsumoto Y, Imai A, Fujita T, Tamura Y, Takahashi N, Gasa S, Matsumoto K, Ohta K, Sugawara F, Sakaguchi K, Jimbow K, Sato N.
  • 雑誌名: Transplant Proc. 37・1
• [雑誌論文] Structural analysis of epolactaene derivatives as DNA polymerase inhibitors and anti-inflammatory compounds. (2005)
  • 著者名/発表者名: Mizushina Y, Kuramochi K, Ikawa H, Kuriyama I, Shimazaki N, Takemura M, Oshige M, Yoshida H, Koiwai O, Sugawara F, Kobayashi S, Sakaguchi K.
  • 雑誌名: Int J Mol Med. 15・5 ページ: 785-793
• [雑誌論文] Affinity capture of a mammalian DNA polymerase beta by inhibitors immobilized to resins used in solid-phase organic synthesis. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kuramochi K, Haruyama T, Takeuchi R, Sunoki T, Watanabe M, Oshige M, Kobayashi S, Sakaguchi K, Sugawara F.
  • 雑誌名: Bioconjug Chem. 16・1 ページ: 97-104
• [雑誌論文] Monolayer membranes and Bilayer vesicles characterized by alpha- and beta-anomer of sulfoquinovosyldiacyglycerol(SQDG). (2005)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto K, Sakai H, Ohta K, Kameda H, Sugawara F, Abe M, Sakaguchi K.
  • 雑誌名: Chem Phys Lipids. 133・2 ページ: 203-214