医薬小分子のアフィニティによる結合タンパク質の決定

2006 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16310155
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 菅原 二三男 東京理科大学, 理工学部, 教授 (30192123)
• キーワード: 医薬 / ファージディスプレイ / 結合タンパク質 / 受容体 / FKBP

研究概要

医薬活性小分子の生体内標的タンパク質の特定のための新規方法論の開発を主要研究課題とした。
本年度は、(1)PEGSを小分子の固定化樹脂とすることにより、非特異的な結合を排除したアフィニティクロマトクラフィー法を開発し、培養細胞からSLF結合タンパク質FKBP12を、(2)ファージディスプレイ法とQCM法を組み合わせたQCM-PD法を考案することにより、極めて短時間にFKBP12遺伝子を選抜することに成功した。
(1)タンパク質のアフィニティ精製に適した有機合成用樹脂を探索するため、SLFを樹脂に固定化させてFKBP12との結合実験を行った。SLF (Synthetic Ligand of FKBP)は、免疫抑制剤のFK506結合タンパク質FKBPと強く相互作用するよう分子設計された化合物である。SLF-固定化樹脂とFKBP12との結合実験では、FKBP12はSLF固定化PEGA樹脂にのみしっかりと吸着することが示された。4mgのSLF固定化PEGAを用い、ヒト白血病Tリンパ腫由来の細胞抽出液からFKBP12を濃縮できることも示された。
(2)SLFプローブを固体表面に種々の分子を高密度・高配向に集積させ、自己組織単分子膜を形成した。比較のためビオチン化SLFを合成し、アビジン固定化金薄膜に固定したものを用意した。終濃度10^7のファージライブラリーを注入したところ、SLF-Biotinからは約20Hz、SLF-SAMからは約90Hzの振動数の減少が検出された。PCRで得られたcDNAペプチド配列に翻訳した結果、SLF-SAMでは、無作為に抽出した48個のファージのうちFKBPを提示しているファージが38%に検出された。一方SLF-Biotinでは、FKBPを提示しているファージは検出されなかった。1 roundわずか10分間の相互作用で検出されたことから、迅速かつ高精度なスクリーニングを達成したと言える。その大きな理由としては、金電極上のSLF-SAMの固定化効率がSLF-Biotinに比べ大幅に上昇したためと考えられる。

研究成果

• [雑誌論文] An emulsion of sulfoquinovosylacylglycerol with long-chain alkanes increases its permeability to tumor cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Aoki S, Ohta K, Matsumoto K, Sakai H, Abe M, Miura M, Sugawara F, Sakaguchi K
  • 雑誌名: J Membr Biol. 213 ページ: 11-18
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Characterization of a second proliferating cell nuclear antigen (PCNA2) from Drosophila melanogaster. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ruike T, Takeuchi R, Takata K, Oshige M, Kasai N, Shimanouchi K, Kanai Y, Nakamura R, Sugawara F, Sakaguchi K
  • 雑誌名: FEBS J. 273 ページ: 5062-5073
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Total synthesis and stereochemistry of the antitumor antibiotics PD 113,271 (2006)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi T, Kuramochi K, Kobayashi S, Sugawara F
  • 雑誌名: Org Lett. 8 ページ: 5307-5310
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Identification of Antibiotic Clarithromycin Binding Peptide Displayed by T7 Phage Particles. (2006)
  • 著者名/発表者名: Morimura T, Noda N, Kato Y, Watanabe T, Saitoh T, Yamazaki T, Takata K, Aoki S, Ohta K, Ohshige M, Sakaguchi K, Sugawara F
  • 雑誌名: J Antibiot. 59 ページ: 625-632
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] The inhibitory action of long-chain fatty acids on the DNA binding activity of p53. (2006)
  • 著者名/発表者名: Iijima H, Kasai N, Chiku H, Murakami S, Sugawara F, Sakaguchi K, Yoshida H, Mizushina Y
  • 雑誌名: Lipids. 41 ページ: 521-527
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Alpha-sulfoquinovosylmonoacylglycerol is a novel potent radiosensitizer targeting tumor angiogenesis. (2006)
  • 著者名/発表者名: Sakimoto I, Ohta K, Yamazaki T, Ohtani S, Sahara H, Sugawara F, Sakaguchi K, Miura M
  • 雑誌名: Cancer Res. 15 ページ: 2287-2295
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Structural relationship of curcumin derivatives binding to the BRCT domain of human DNA polymerase lambda (2006)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi T, Ishidoh T, Iijima H, Kuriyama I, Shimazaki N, Koiwai O, Kuramochi K, Kobayashi S, Sugawara F, Sakaguchi K, Yoshida H, Mizushina Y
  • 雑誌名: Genes Cells. 11 ページ: 223-235
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] A high-throughput phage display screening method using a combination of real-time PCR and affinity chromatography. (2006)
  • 著者名/発表者名: Morohashi K, Arai T, Saito S, Watanabe M, Sakaguchi K, Sugawara F
  • 雑誌名: Comb Chem High Throughput Screen. 9 ページ: 55-61
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 5-(Hydroxymethyl)-2-furfural : a selective inhibitor of DNA polymerase lambda and terminal deoxynucleotidyltransferase. (2006)
  • 著者名/発表者名: Mizushina Y, Yagita E, Kuramochi K, Kuriyama I, Shimazaki N, Koiwai O, Uchiyama Y, Yomezawa Y, Sugawara F, Kobayashi S, Sakaguchi K, Yoshida H
  • 雑誌名: Arch Biochem Biophys. 446 ページ: 69-76
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Site-directed mutational analysis of structural interactions of low molecule compounds binding to the N-terminal 8kDadomain of DNA polymerase beta. (2006)
  • 著者名/発表者名: Murakami S, Kamisuki S, Takata K, Kasai N, Kimura S, Mizushina Y, Ohta K, Sugawara F, Sakaguchi K
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 350 ページ: 7-16
• [雑誌論文] Structural relationship of cureumin derivatives binding to the BRCT domain of human DNA polymerase lambda. (2006)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi T, Ishidoh T, Iijima H, Kuriyama I, Shimazaki N, Koiwai O, Kuramochi K, Kobayashi S, Sugawara F, Sakaguchi K, Yoshida H, Mizushina Y
  • 雑誌名: Genes Cells. 11 ページ: 223-35
• [雑誌論文] Total synthesis of (-)-neoechinulin A (2006)
  • 著者名/発表者名: Toshiaki Aoki, Shinji Kamisuki, Masaaki Kimoto, Kensuke Ohnishi, Yoichi Takakusagi, Kouji Kuracmohi, Yoshifumi Takeda, Atsuo Nakazaki, Kenji Kuroiwa, Takashi Ohuchi, Fumio Sugawara, Takao Arai, Susumu Kobayashi
  • 雑誌名: Synlett. 2006 ページ: 677-680
• [雑誌論文] 生理活性物質Sulfoquinovosylacylglycerolの生体内標的分子検索 (2006)
  • 著者名/発表者名: Satoko Aoki, Keisuke Ohta, F.Sugawara, K.Sakaguchi
  • 雑誌名: 札幌医科大学医学部付属臨海医学研究所紀要 6 ページ: 27-34
• [図書] 生物有機化学 : 基礎化学編 (2007)
  • 著者名/発表者名: 菅原二三男
  • 総ページ数: 405
  • 出版者: 丸善
• [図書] 生物有機化学 : 有機化学編 (2007)
  • 著者名/発表者名: 菅原二三男
  • 総ページ数: 240
  • 出版者: 丸善
• [図書] 生物有機化学 : 生化学編 (2007)
  • 著者名/発表者名: 菅原二三男
  • 総ページ数: 402
  • 出版者: 丸善