| 研究課題/領域番号 |
16350093
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 早稲田大学 |
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研究代表者 |
小松 晃之 早稲田大学, 理工学術院, 助教授 (30298187)
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| 研究分担者 |
黄 宇彬 早稲田大学, 理工学術院, 講師 (20386725)
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| キーワード | 蛋白質 / 生物無機化学 / バイオテクノロジー / 生体系類似化学 / アルブミン-プロトヘム / 遺伝子組換えアルブミン / 合成ヘム蛋白質 / 酸素錯体 |
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| 研究概要 |
本研究は、ヒト血清アルブミンのヘムポケット内部にヒスチジンを変異導入した組換えアルブミンを合成し、プロトヘム誘導体を軸配位により固定、従来に類例のない酸素輸送合成ヘム蛋白質(アルブミン-プロトヘム錯体)を創製することを目的とする。
初年度は、計画に沿った展開を実施し、予想以上の成果を得ることができた。(1)近位塩基(ヒスチジン)を導入した組換えアルブミンを発現、プロトヘムを配位結合させることにより、新しい合成ヘム蛋白質を構築、(2)酸素結合定数(酸素親和度)、酸素結合解離速度定数、酸素錯体安定度をパラメーターとして酸素結合能を評価、ヘモグロビンやミオグロビンと比較した。(3)酸素配位座近傍のアミノ酸も変換し、安定酸素錯体を形成できる条件を解明。(5)得られたアルブミン-プロトヘム錯体のX線結晶構造解析のため、単結晶作成に着手した。
(1)組換えアルブミンの発現とプロトヘム錯体の調製
ヘムポケット内部にヒスチジンを有する組換えアルブミン(3種)を合成。得られた組換えアルブミンにプロトヘムを結合させ、組換えアルブミン-ヘム錯体を得た。
(2)組換えアルブミン-プロトヘムの酸素結合能
酸素結合定数、酸素結合解離速度定数を高速反応計測システム(設備備品として設置)を用いて測定、酸素輸送ヘム蛋白質としての機能を評価した。酸素親和度はミオグロビンに比べて低く、これは大きな解離速度定数に起因する。
(3)ヘムポケット構造と酸素結合能の相関
酸素配位座近傍にあるTyr-161を疎水性アミノ酸残基に変換することが、安定酸素錯体の生成条件であることを見出した。
(4)組換えアルブミン-プロトヘムの単結晶作成
アルブミン-プロトヘム錯体の結晶構造を決定するため、Prof.S.Curry(海外協力研究者)の協力を得た。協議・共同実験は小松が短期滞在して実施した。
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