研究課題
本研究課題はヒト細胞を用いて、染色体複製の開始に働くにORCが、染色体分配・細胞質分裂など、他の細胞周期イベントへの関与とその機能メカニズムを、ORCと相互作用する因子をプロテオミクスによる手法を用いて網羅的に明らかにすることにより解明する。本年度は、ヒトORC1と共精製したタンパク質を質量分析で検索する過程で同定したTRF2について、詳細に解析を行った。TRF2はテロメアで機能する因子である。免疫沈降法、プルダウン方によりTRF2とORCあるいはCDC6との結合が確認された。また、ORC1が直接TRF2と結合し、主にTRF2のmybドメインに介していることが示唆された。一方、CDC6はTRF2の塩基性ドメインに結合することが示唆された。今回の結果から、TRF2はORCやCDC6の結合を促進し、Pre-RC形成を行っている可能性が考えられた。一方で、テロメア領域の複製制御あるいは構造維持に関わっている可能性も示唆された。機能的な解析は十分ではないが、ヒト正常繊維芽細胞においてshRNAの発現によりTRF2の抑制を行ったところ、S期進入の遅延が認められ、複製開始あるいは他の細胞周期イベントへの関与を示唆する結果を得ている。ORCと直接結合しヘテロクロマチン形成に重要な役割をしているHP1について、動原体タンパク質Mis12複合体との結合を昨年度見いだした。これについて、2ハイブリッド法などを用いて、詳細にその相互作用を検討したところ、Mis12複合体はHP1のクロモシャドウドメインを介して結合すること、HP1との結合がMis12複合構築に影響を及ぼすことを示唆する結果を得た。ORCはクロモドメインを介してHP1と結合すること、分裂酵母のORCは動原体に局在することが知られていることから、ORCはHP1を介してMis12と協調して染色体分配に必要な機能的な複合体形成のステップに寄与している可能性が考えられた。
すべて 2006
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Genes Cells (in press)
EMBO J. (in press)
