| 研究課題/領域番号 |
16370084
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
中山 啓子 東北大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (60294972)
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| 研究分担者 |
石田 典子 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (10361073)
原 賢太郎 東北大学, 大学院・医学系研究科, COEフェロー (60400248)
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| キーワード | ユビキチン化 / ノックアウトマウス / 蛍光色素標識 / プロテオーム |
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| 研究概要 |
時間的・空間的なタンパク質の発現量調節システムの全貌を理解することを目標に本研究を行った。本研究では、遺伝子改変動物(ノックアウトマウス等)を用いて、遺伝子改変によって生ずるタンパク質の変化を網羅的に検索するシステムを構築し、ユビキチンリガーゼの生理的基質の同定を試みた。
本年度は、抗ユビキチン抗体を用いた精製法によるユビキチン化蛋白質の特異的精製を試みた。ユビキチンは細胞内で量的に多い蛋白質であり、そのほとんどが遊離の状態(基質に結合していない)で存在しているため、通常の抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うと、主に遊離ユビキチンが回収される。そこで、われわれは抗ユビキチンモノクローナル抗体であるFK2が基質と共有結合したユビキチンを選択的に認識できることに着目し、FK2-カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによるユビキチン化蛋白質の濃縮を行った。野生型およびノックアウトマウスより電動実体顕微鏡を用いて正確に臓器ごとに分離し、そのタンパク質抽出液を調製し、上記の方法で濃縮後、それぞれの抽出液に異なる蛍光色素標識を行った。これらの標識タンパク質を同量混合し、発光を計測する。その際、あらかじめラベルされたタンパク質をタンパク二次元電気泳動法などで展開しておけば、量的に増加または減少したタンパク質を発光色の変化としてとらえることが可能である。この方法を用いて、ノックアウトマウスで特異的に蓄積しているタンパク質の存在を知ることに成功した。現在、質量分析を行い、タンパク質の同定を行っている。
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