研究課題
基盤研究(B)
本研究では、ハイスループットな蛋白質間相互作用解析手法を確立し、それを用いてイネの多数の蛋白質の機能ネットワークを解明することを目的とする。まず、ステンレスにダイヤモンド様炭素被膜処理して得られる基板(DLC基板)に電気泳動で分離した蛋白質を転写し、転写された蛋白質と結合する蛋白質を質量分析装置で検出するため、蛋白質の発現が比較的活発なイネ発芽直後の幼根および幼植物地上部の蛋白質を二次元電気泳動で分離し、DLC基板に固定化してプロテインチップを作製した。この際、DLC基板に固定化された蛋白質がどんな蛋白質であるかを明らかにするため、二次元電気泳動で蛋白質を分離した後、ゲル中でトリプシンまたはリシルエンドペプチダーゼで消化し、消化物を質量分析して得られたペプチドマスフィンガープリントに基づいて同定した。一方、タンデムアフィニティー精製(TAP)法によって、特定の蛋白質と親和性のある蛋白質にアフィニティータグを付した融合蛋白質をコードするDNAをイネで発現させ、これに結合する蛋白質をタグとの親和性を利用して精製し、相互作用する蛋白質を同定する系の確立を目指した。ユビキチン結合酵素をコードするCdc34とTAPタグを導入したベクターに融合蛋白質を発現させ、Cdc34蛋白質粗抽出液を得た。SDS-PAGEで分離し、発現したタグ付き蛋白質がCdc34であることを、抗TAP抗体,抗Cdc34抗体を用いたウエスタンブロッティング法や質量分析法によって確認した。次に粗抽出液をIgGカラム、カルモジュリンカラムを用いて2段階精製を行い、精製された蛋白質複合体を質量分析によって解析した。その結果、ユビキチン結合酵素と相互作用することが知られている蛋白質が同定された。従って、この系がうまく機能していると判断された。
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