研究課題
本研究では、ハイスループットな蛋白質間相互作用解析手法を確立し、それを用いてイネの多数の蛋白質の機能ネットワークを解明することを目的とする。これまでに蛋白質の発現が比較的活発なイネカルスの蛋白質を二次元電気泳動で分離し、ダイヤモンド様炭素を被膜処理して得られるステンレス基板(DLC基板)にエレクトロブロッティングによって転写・固定化してプロテインチップを作製する方法を開発することができた。そして、固定化した蛋白質と相互作用する蛋白質やペプチドを解析する方法をほぼ確立することができた。そこで、本年度は、二次元電気泳動で分離され、DLC基板上に転写された蛋白質のうち、糖鎖を含有するものをDLC基板上で検出し、質量分析装置によって同定することができるかどうか調べた。まず、イネカルス蛋白質およびダイズ種子蛋白質を二次元電気泳動で分離し、DLC基板に転写した。これに、アスパラギン結合型高マンノース型糖鎖と特異的に反応するCy5標識したコンカナバリンA(Con A)を反応させた。その結果、ダイズ種子蛋白質に関しては、Con Aと反応した蛋白質を蛍光によって検出することができた。また、Con Aと反応した蛋白質を基板上でトリプシン消化後、質量分析装置によって同定することができた。しかし、イネカルスについては、Con Aと反応する蛋白質を検出することができなかった。これはイネカルス抽出液中の蛋白質の量が十分でなかったためと推定される。今後、微量の蛋白質でも検出できるようさらに高感度な方法を開発することが必要である。
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