| 研究課題/領域番号 |
16380058
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 長岡技術科学大学 |
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研究代表者 |
福田 雅夫 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (20134512)
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| 研究分担者 |
政井 英司 長岡技術科学大学, 工学部, 助教授 (20272867)
千田 俊哉 産業技術総合研究所, 生物情報解析研究センター, 主任研究員 (30272868)
宮内 啓介 長岡技術科学大学, 工学部, 助手 (20324014)
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| キーワード | PCB / 転写制御 / 二成分制御系 / biodegradation |
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| 研究概要 |
PCB分解菌Rhodococcus sp.RHA1のPCB分解遺伝子群の転写を担うBphS1T1及びBphS2T2について以下の解析をおこなった。
BphSのin vivo解析については、ビフェニル(BP)に対する応答能を持つBphS1と持たないBphS2のキメラ酵素を作製し、そのBPに対する応答性をルシフェラーゼをレポーター遺伝子として用いて測定した。その結果、BP認識に関与する部位はN末端に存在することが明らかとなった。さらに領域を縮小することによって、約1500アミノ酸中の141番目から405番目のアミノ酸にBP応答に関与する領域が存在することを明らかにした。
また、BphS1の基質特異性変異体を構築するため、抗生物質耐性遺伝子をレポーターとした変異体スクリーニングの系を構築し、ハイドロキシルアミンを用いて化学的に変異を導入することで、BphS1が応答しない4-クロロビフェニル存在下でbphA1プロモーターからの転写を活性化する変異体の取得を試みた。その結果、構成的にbphA1プロモーターからの転写を活性化するBphS1変異体を4種類取得した。これらは全て異なる位置に変異を保持していた。
BphS、BphTのin vitro解析のために、それぞれの酵素の発現系の構築を試みた。BphS1については、N末にチオレドキシンタグを付加し、低温で発現誘導をおこなうことで、大腸菌中での発現に成功した。しかし、その発現量は低く、さらに条件検討をする必要がある。BphT1については、N末にチオレドキシンタグを付加した系での発現に成功した。また、N末にヒスチジンタグを付加した系についても検討した。その結果、発現したBphT1は全て不溶性画分に現れたが、分子シャペロンを共発現させることによって可溶性画分として発現させることに成功した。
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