| 研究課題/領域番号 |
16380058
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| 研究機関 | 長岡技術科学大学 |
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研究代表者 |
福田 雅夫 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (20134512)
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| 研究分担者 |
政井 英司 長岡技術科学大学, 工学部, 助教授 (20272867)
千田 俊哉 産業技術総合研究所, 生物情報解析研究センター, 主任研究員 (30272868)
宮内 啓介 長岡技術科学大学, 工学部, 助手 (20324014)
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| キーワード | PCB / 転写制御 / 二成分制御系 / biodegradation |
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| 研究概要 |
PCB分解菌Rhodococcus sp. RHA1のPCB分解遺伝子群の転写を担うBphSBphTについて以下の解析をおこなった。
BphSのin vitro解析のために高発現系の構築を試みているが、全長の高発現にはいたらなかった。一般にセンサーキナーゼのC末端のみを発現させた部分タンパク質は構成的キナーゼとなることが知られているため、BphSにおいてもキナーゼドメインを含み、細胞質側に局在すると考えられるC末端側216アミノ酸からなる部分タンパク質を、lacプロモーターを用いて大腸菌中で発現させたが、発現したタンパク質は不溶性画分に分画され、同じタンパク質をRhodococcus中で発現させたときにもBphT1の活性化は観察されなかった。そこで、BphS1のN末からexonucleaseによってランダムにbphs1を欠失させ、構成的にBphTを活性化するBphS1部分タンパク質をルシフェラーゼ活性をレポーターとして選抜することにした。現在欠失体作製用のプラスミドの作製が終了したところである。また、昨年度取得したBphS1の構成的活性化型変異体については、本変異体を導入したRHA1株が、非誘導条件で培養した際も塩化ビフェニル分解能を示すことを確認した。
BphT1のin vitro解析のために、発現系の構築を昨年度に引き続き試みた。N末にヒスチジンタグを付加し、低温で転写が誘導されるcspAプロモーター下に挿入して大腸菌を宿主に発現を試みたところ、可溶性画分にHis-BphT1由来のバンドが確認された。 His-BphT1とbphA1プロモーターの相互作用をゲルシフト解析で観察したが、結合によるバンドのシフトは観察されなかった。チオレドキシンタグを付加したBphT1に関しても同様の結果であった。両組換えBphT1はRhodococcus中で活性を示すことを確認しているため、今後はゲルシフト解析の条件検討を引き続き行う。構造解析に向けたBphT1の精製も試みているが、結晶化条件検討に必要な酵素量が得られていない。
マイクロアレイ解析については、RHA1菌体からのRNAの回収及びそれを用いたアレイ解析の系を立ち上げた。現在bphS破壊株を用いてBphS制御下にある遺伝子群の同定を試みている。
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