| 研究課題/領域番号 |
16380200
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
服部 真彰 九州大学, 大学院農学研究院, 教授 (60175536)
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| 研究分担者 |
山内 伸彦 九州大学, 大学院農学研究院, 助教授 (00363325)
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| キーワード | 卵子 / 顆粒層細胞 / 共培養 / 転写因子 / cAMP / FSH / レポータージーンアッセイ / 制御領域 |
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| 研究概要 |
体細胞-体細胞間、生殖細胞-体細胞間および胚-体細胞間のパラクリン因子やオートクリン因子の発現時期や作用期間をリアルタイムに計測するシステムとして、情報受信側の細胞の標的遺伝子の上流域に存在する制御領域を情報受信としたレポーターアッセイは有効な検出システムである。卵子と顆粒層細胞で発生するパラクリン因子の検索に加えて、未分化細胞で発現するオートクリン因子および胚が子宮に着床するときに発現するパラクリン因子による情報発信をリアルタイムに検出する方法の開発を行った。未分化細胞が発信する情報を解析するために、標的遺伝子のプロモター領域に存在するSmad応答配列(コンセンサス)を合成して、それぞれpGL3ベクター(ルシフェラーゼ遺伝子を連結)に導入、大腸菌に導入してクローニング、常法にしたがってプラズミドを精製した。このプラズミドを目的の細胞(ニワトリ胚由来筋芽細胞)にリポフェクションにより導入した。また、ラット子宮内膜間質細胞に存在するプロゲステロン受容体あるいは前立腺細胞に存在するアンドロゲン受容体に応答するコンセンサス配列を合成して、同様にクローニング、細胞導入を行った。ステロイドホルモン受容体の場合、それぞれのステロイドホルモンあるいはその受容体アンタゴニストを添加することにより、検出系の正確な評価を行った。いずれも予想される結果が得られ、本検出系は広く応用できることが示唆された。しかし、改良すべき点として、レポータータンパク質を発光強度として測定しているために、ルシフェラーゼの半減期を短くしたベクターを使用すること、遺伝子導入効率を一定にすること、分化細胞のアポトーシス抑制などが挙げられる。
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