| 研究課題/領域番号 |
16390017
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
物理系薬学
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
山口 佳宏 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 助手 (10363524)
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| 研究分担者 |
黒崎 博雅 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 助教授 (70234599)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| キーワード | 加水分解酵素 / β-ラクタム剤 / 基質認識機構 / 阻害剤開発 / 部位特異的変異法 / X線結晶構造解析 / 速度論的解析 |
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| 研究概要 |
感染症で汎用されているβ-ラクタム剤を加水分解し、活性中心にZn(II)イオンを要求するメタロ-β-ラクタマーゼ(IMP-1)は、ほとんどすべてのβ-ラクタム剤を認識すること、既存のβ-ラクタマーゼ阻害剤が無効であることから、基質認識機構解明と阻害剤開発が急務となっている。
IMP-1の活性中心近傍にはヘアピンループがあり、その頂点には基質・阻害剤と相互作用するTrp残基が位置している。Trp残基は構造解析などから可動性を持つことがわかっており、ループ頂点のアミノ酸配列Gly63-Trp64-Gly65が関与していると考えられた。そこで、3種の変異体を調製して、速度論的パラメータおよび阻害剤に対する阻害定数を算出した。これらの結果から、Trp64-Gly65の配列がTrp残基と基質・阻害剤認識に重要な役割を担っていることがわかった
また合成されたメルカプトプロピオン酸活性エステル誘導体(MPAP)がIMP-1に対して非可逆的に阻害することがわかっている。そこでMPAPとIMP-1の結合様式を調べるために、X線結晶構造解析を行った。複合体中では、MPAPのチオール基は活性中心の2つのZn(II)イオンに架橋して配位し、IMP-1のLys224と共有結合(アミド結合)していることがわかった。
IMP-1は活性中心に2つのZn(II)イオンを含んでいるが、酵素当たりのZn(II)イオンの数、その結合定数は活性発現機構解明を解き明かす上で重要にも関わらず、詳細な検討が行われていない。そこでIMP-1からZn(II)イオンを取り除いたapo IMP-1に、Co(II)イオンに置換したCo(II)置換IMP-1の分光学的研究とapo IMP-1に1当量のZn(II)イオンを加えて調製した。分光学的研究から1つ目のZn(II)イオンは2つのZn(II)結合サイトに分布していることが示唆された。
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